菌根真菌與根瘤菌聯合作用對降香黃檀幼苗根系構型及養(yǎng)分吸收的影響

王宏信， 冷 凝， 劇春暉， 陳 博， 陳文術， 李向林， 冉 旭

(1.三亞學院，海南三亞 57200； 2.西南大學資源環(huán)境學院，重慶 400715；3.北華大學東北紅豆杉繁育技術研究所，吉林吉林 132013)

降香黃檀(DalbergiaodoriferaT. Chen)為蝶形花科降香黃檀屬落葉喬木，是海南特有的珍稀瀕危樹種，具有較高的經濟價值和生態(tài)價值[1-2]。植物的根系構型，例如根系分枝數量、根生長角度、根長、根表面積、根體積、根尖數以及不同徑級間的長度、面積、體積、根尖數等對水分及營養(yǎng)物質的吸收起著關鍵的作用[3]。土壤根際微生物是土壤中各種生物學和生物化學過程的重要構成因子，它對植物的根系構型有重要的影響，同時植物根系構型的改變也會影響微生物群落的構成與分布[4]。目前，研究較多的是叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)、根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)等根際微生物如何有效地調控植物根系構型[5-6]。AMF能與陸地上90%的開花植物形成共菌根生體，能夠改變宿主植物的根系構型、增加植物對土壤礦質元素和水分的吸收利用，提高植物抗旱性和抗逆性[7-9]。根瘤菌與根系形成的共生體，通過固氮作用為植物生長提供所需的氮源[10]。研究表明，根瘤菌可以促進蒺藜狀苜蓿的根毛卷曲及增加分枝程度，進而側根數量增多[11]，且能夠有效提高棉花根干質量、根生物量和根表面積等根系生物指標[12]。在豆科植物的根際生態(tài)系統(tǒng)中，存在AMF-豆科植物-根瘤菌的共生體系[13]，研究表明，干旱條件下，同時接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)和大豆慢生根瘤菌(BradyrhizobiumjaponicumJordan)，能夠提高大豆的結瘤量，避免大豆根瘤過早衰老[14]。更多的研究表明，AMF與根瘤菌的雙接種可以強烈地刺激豆科植物的生長和根瘤的形成，使AMF侵染率增加，從而達到對養(yǎng)分吸收的協同促進作用，其優(yōu)越性遠遠大于它們的單獨接種[15-16]。

有研究表明，接種珠狀球囊霉(Glomusmargarita)和幼套球囊霉(Glomusetunicatum)可促進滅菌土中生長的降香黃檀幼苗生長[17]，另研究表明混合接種摩西球囊霉和疣狀無梗囊霉(Acaulosporatuberculata)能促進滅菌土中降香黃檀幼苗的生長發(fā)育并提高其抗逆性[18]。慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)等多種根瘤菌能夠與降香黃檀形成穩(wěn)定的共生關系，從而形成根瘤固氮，提高其抗逆性[19]。然而目前，接種AMF和根瘤菌如何影響幼齡降香黃檀幼苗的生物量和根系形態(tài)特征及其能否促進根系生長和養(yǎng)分吸收等相關研究較少。

本研究通過為幼齡降香黃檀實施AMF、根瘤菌和混合接種的方式來探討AMF和根瘤菌對根系生長和養(yǎng)分吸收的影響，為降香黃檀大面積推廣栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗土壤采自三亞學院園林試驗基地林下表層土。土壤類型為磚紅壤，土壤pH值4.56，全氮含量為0.73 g/kg，有機質含量為11.118 g/kg，全磷含量為0.182 g/kg，全鉀含量為4.135 g/kg，田間持水量為21.8%。土壤過2 mm篩，在 0.14 MPa、121 ℃下連續(xù)滅菌2 h備用。試驗種子采自海南省三亞市熱帶珍稀苗木種植場，降香黃檀樹齡20年，其種子用5%次氯酸鈉溶液消毒20 min，然后用無菌水沖洗備用。經過前期試驗篩選，供試菌根真菌種為幼套球囊霉(G.etunicatum，GE)，由中國農林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所提供，菌根真菌采用高粱苗為宿主進行盆栽擴繁，以含有宿主植物侵染根段、菌絲片段、菌根真菌孢子的根際土為接種劑。供試根瘤菌為慢生根瘤菌(B.japonicum，BJ)，購自中國農業(yè)大學根瘤中心。

盆栽容器為45 cm×32 cm×25 cm(盆高×盆口直徑×盆底直徑)紅色塑料盆，使用前用95%乙醇消毒，自來水沖洗干凈后備用。每盆裝土4.8 kg。

1.2 試驗設計

試驗在三亞學院園林試驗大棚中進行，該地塊位于海南省三亞市吉陽區(qū)，地處109°53′92″E、18°32′72″N，海拔200 m。大棚四周與外界溫度、濕度、光照相對一致，年平均降水量為1 755 mm，年平均相對濕度為78%，年平均氣溫為25 ℃。試驗時間為2016年7月17日至2017年7月17日，試驗設4個處理：不接種(對照CK)、單接種幼套球囊霉(GE)、單接慢生根瘤菌(BJ)、雙接種幼套球囊霉與慢生根瘤菌(GE+BJ)，每個處理6個重復，共計24盆。培養(yǎng)土裝盆時，在基質的2/3處平鋪菌劑100 g，接種AMF的處理加入含有孢子、菌絲的土壤及其寄主植物的根段混合物作為接種物，同時播入消毒并催芽的降香黃檀種子，未接種的處理加入等量滅活菌劑和滅菌的沙子作為對照。接種根瘤菌的方法是將供試菌株先接種到YMA斜面活化，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，然后轉接于YMA培養(yǎng)液(1 000 mL)的三角瓶中，振蕩30 h，培養(yǎng)至對數生長期(D600 nm=0.812)，離心濃縮并用無菌水重懸，配制成菌懸液(菌數約104CUF/mL)，每盆接種100 mL根瘤菌劑，不接種的對照注射100 mL無菌水。2016年7月7日播種，1個月后定苗至6株并施肥(硝酸銨200 mg/kg、磷酸二氫鉀50 mg/kg、硝酸鉀300 mg/kg)。

1.3 指標測定

1.3.1 生長發(fā)育測定 播種2個月后，用卷尺和游標卡尺測量株高和地徑，每個月測定1次。

1.3.2 根系形態(tài)測定 2017年7月17日收獲，將植株連同塑料盆同時浸入水中，沖洗掉根部土壤，獲取完整根系，用根系掃描儀Epson Perfection 4990 PHOTO進行掃描測定總根長、根系總表面積、根體積、根尖數、根分枝數，分析軟件為Regentinstruments公司提供的WinRHIZO。

1.3.3 地下根瘤數量及根瘤質量測定 根系掃描完畢后，計算每株根瘤數并用游標卡尺隨機測定30個根瘤的直徑，取平均值。

1.3.4 生物量測定 測定后的植株從基徑處分開，地上部稱鮮質量，105 ℃殺青30 min后置于70 ℃烘干，稱干質量，計算干鮮比，換算出地上生物量；地下部分分成2份：一份用來測定AMF侵染率，另一份105 ℃殺青30 min后置于70 ℃烘干，稱干質量，計算干鮮比，換算出地下生物量。

根冠比=地上干質量/地下干質量。

1.3.5 主根長度、側根長度測定 長度測定精確到0.01 cm。

1.3.6 AMF侵染率測定 參照Phillips等方法進行染色觀察菌根侵染情況，稱取約0.1 g的根，剪成約1 cm的小段，放入裝有10% KOH的試管中，80 ℃水浴20 min，用1% HCl洗滌，再用蒸餾水沖洗干凈；用0.065%苯胺藍染液在80 ℃水浴中染色10 min，洗凈后用甘油保存并在解剖鏡下鏡檢[20]。

1.3.7 植物養(yǎng)分含量測定 植物組織中氮(N)、磷(P)經濃硫酸-雙氧水消解后分別用凱氏定氮法、釩鉬黃比色法、火焰光度計法測定含量[21]。

1.4 數據處理

采用SPSS 18.0軟件單因素完全隨機法進行數據統(tǒng)計，檢驗處理間的差異顯著性。采用Excel 2007軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同接種方式對降香黃檀幼苗植株株高、地徑的影響

如圖1、圖2所示，接種AMF和根瘤菌均對降香黃檀幼苗株高和地徑產生顯著影響。2016年9月17日至2017年6月17日，連續(xù)測量10個月后，GE、BJ、GE+BJ處理株高分別比CK增加19.84%、6.81%、19.69%，其中GE處理與 GE+BJ處理差異不顯著，其余各處理間差異顯著(P<0.05)。GE、BJ、GE+BJ處理地徑分別比CK增加25.62%、5.66%、24.85%，其中GE處理與GE+BJ處理差異不顯著，其余各處理間差異顯著(P<0.05)。說明接種AMF和根瘤菌顯著促進了降香黃檀幼苗株高和地徑的生長，單獨接種AMF的效果優(yōu)于單獨接種根瘤菌效果，而雙接種產生協同效應。10個月后，CK、GE、BJ、GE+BJ處理株高與地徑的凈增長量分別為8.45、11.23、9.35、11.03 cm和2.85、3.85、3.07、3.79 mm。

2.2 不同接種方式對降香黃檀幼苗植株的菌根侵染率、根瘤數量、根瘤質量、生物量及根冠比影響

如表1所示，雙接種GE+BJ處理的降香黃檀幼苗菌根侵染率比單獨接種AMF的GE處理略高，但差異不顯著。雙接種GE+BJ處理的降香黃檀根瘤數量和根瘤質量比單獨接種根瘤菌的BJ處理增加15.92%和32.35%，且差異顯著(P<0.05)。苗木的生物量及其根冠比是苗木生長狀況的重要指標。由表2可知，接種AMF和根瘤菌均可以增加降香黃檀幼苗的生物量及其根冠比，而且各處理與CK處理相比差異均顯著(P<0.05)。GE、BJ、GE+BJ處理的總干質量、總鮮質量、地上部干質量、地上部鮮質量、地下部干質量、地下部鮮質量分別比CK處理增大125.3%、61.9%、130.8%，125.5%、61.9%、131.2%，112.1%、56.7%、117.7%，112.5%、57.0%、117.8%，149.6%、70.8%、156.6%，150.0%、71.4%、156.6%。根冠比是表征植物地上和地下生物量分配的重要指標。單獨接種AMF和根瘤菌以雙接種的處理根冠比均顯著高于CK對照處理(P<0.05)，說明AMF和根瘤菌對降香黃檀幼苗的地上部、地下部生物量產生了顯著的影響，調節(jié)了植物體內碳庫-碳源的流通分配過程。

表1 不同處理對降香黃檀幼苗的菌根侵染率、根瘤數量、根瘤質量的影響

注：表中同列數據后不同小寫字母表示不同處理間達顯著差異(P<0.05)。下同。

表2 不同處理對降香黃檀幼苗的生物量的影響

2.3 不同接種方式對降香黃檀幼苗植株的根系構型的影響

植物根系構型是植物重要的植物學性狀和生態(tài)學指標，除受植物的遺傳因素調控外，還受環(huán)境因子的調控，而環(huán)境因子往往通過影響側根的發(fā)生來影響根系構型[22]。如表3所示，3個處理GE、BJ、GE+BJ總根長分別比CK處理增加41.54%、13.80%、38.19%，其中GE和GE+BJ處理與CK處理差異顯著(P<0.05)；4個處理間主根長差異并不顯著；GE、BJ、GE+BJ處理的一級側根長度分別比CK處理增加43.65%、13.62%、50.27%，其中GE、GE+BJ處理均與CK處理差異顯著(P<0.05)；GE、BJ、GE+BJ處理的二級側根長分別比CK處理增加53.94%、22.23%、7.82%，其中只有GE處理與CK處理差異顯著(P<0.05)；4個處理的三級側根長差異均不顯著。

表3 不同處理對降香黃檀幼苗的主側根根長的影響

如表4所示，GE、BJ、GE+BJ處理與CK相比，根表面積分別增加64.42%、42.17%、89.56%；根體積分別增加 35.54%、10.74%、40.77；平均根系直徑分別增加46.61%、25.42%、51.69%；根尖數分別增加40.37、12.48%、45.94%；根分枝數分別增加64.33%、28.73%、74.78%。根系表面積和根系體積是根系在土壤中分布范圍的重要指標，3個接種處理根系表面積和根系體積與CK處理差異顯著(P<0.05)，說明接種AMF和根瘤菌明顯擴展了降香黃檀幼苗根系的分布范圍。平均根系直徑、根尖數、根分枝數則反映植物根系的吸收能力，3個接種處理平均根系直徑、根尖數、根分枝數與CK處理差異顯著(P<0.05)，說明接種AMF和根瘤菌明顯增加了降香黃檀幼苗根系的吸收能力。

表4 不同處理對降香黃檀幼苗的根系構型的影響

2.4 不同接種方式對降香黃檀幼苗植株N、P含量的影響

如表5所示，降香黃檀幼苗地上部、地下部N、P含量均表現為GE+BJ>GE>BJ>CK。與CK相比，3個處理GE、BJ、GE+BJ地上部和地下部的N含量分別增加53.87%、8.53%、56.27%和79.17%、24.17%、95.00%，且GE和GE+BJ處理與其他2個處理之間差異顯著(P<0.05)；與CK相比，3個處理GE、BJ、GE+BJ地上部和地下部的P含量分別增加92.68%、12.20%、95.12%和66.67%、6.67%、100.00%，其中GE和GE+BJ處理的地上部P含量與其他2個處理之間差異顯著(P<0.05)，GE、GE+BJ處理的地下部P含量與其他2個處理之間差異顯著(P<0.05)。

表5 不同處理對降香黃檀幼苗的N、P含量的影響

3 結論與討論

前人研究結果表明，AMF和根瘤菌對宿主植物根的識別、侵入、誘導，使植物根系發(fā)生形態(tài)和生理上的變化，并與植物建立共生關系，這一過程與根系分泌的信號分子的誘導有關[23]。接種AMF能夠提高對宿主植物葉片的蒸騰速率和氣孔導度，進而影響宿主植物的生物量和一些生理指標[24-25]。本試驗以降香黃檀幼苗為材料，研究雙接種AMF和根瘤菌對降香黃檀幼苗生長的影響。結果表明，接種AMF和根瘤菌均可以增加降香黃檀幼苗的地上、地下生物量、株高、地徑及其根冠比，其中雙接種GE+BJ處理增加幅度最大。李雅慧等研究也發(fā)現，雙接種AMF和根瘤菌顯著促進菜豆的生長[26]。吳福勇等研究發(fā)現，雙接根瘤菌與摩西球囊霉處理對沙打旺生長效應顯著高于單接菌處理[15]。這表明AMF和根瘤菌聯合作用，能促進植物生長發(fā)育。

前人研究結果表明，AMF分泌物對宿主植物的根瘤形成具有促進作用，對根瘤呈現正趨化作用[27]。本試驗結果表明，幼套球囊霉能夠和降香黃檀幼苗根系形成良好的共生關系，侵染率達到80.93%，而在根瘤菌的作用下，AMF侵染率略有提高，達到85.13%。同樣，在AMF作用下，降香黃檀幼苗根系產生的根瘤數量和根瘤質量比單接種根瘤菌處理都有提高，并達到顯著水平，這與前人的研究結果[28-29]是相似的。這也表明AMF和根瘤菌在侵染降香黃檀幼苗過程中是相互促進的。

植物的根系構型直接決定植物的固土能力和養(yǎng)分吸收空間的大小，同時反映了植物根系的生長狀況及其對養(yǎng)分和水分吸收的能力。側根的生長狀況是植物根系發(fā)育的重要指標。本試驗結果表明，雙接種AMF和根瘤菌顯著促進降香黃檀幼苗總根長、主根長和一級側根長，同時提高了根系的根表面積、根體積、平均根系直徑、根尖數量和根分枝數。這表明雙接種AMF和根瘤菌大幅提高降香黃檀幼苗的根系的分布范圍，增加了植株對營養(yǎng)物質和水分的吸收面積，這與前人的研究結果[30]是一致的。

根瘤菌通過生物固氮為寄主植物提供有效的氮源，促進寄主植物生物量增加，寄主植物為AMF生長提供充足的氮素，提高AMF侵染率，而AMF為宿主植物提供有效的磷營養(yǎng)，促進其生物量的提高。本試驗結果表明，雙接種AMF和根瘤菌促進降香黃檀幼苗地上部、地下部N、P含量作用最為明顯。前人研究顯示，雙接種AMF與根瘤菌處理根瘤干質量、N吸收量及固氮速率均顯著高于單接AMF或單接根瘤菌處理[31]。

綜上所述，AMF及根瘤菌在侵染降香黃檀幼苗的過程中，能夠相互促進彼此對降香黃檀幼苗的侵染。AMF侵染率的提高，增加了降香黃檀對土壤中P的吸收，而根瘤菌的侵染能力增強，也加大了其對降香黃檀N營養(yǎng)的供應能力。N、P營養(yǎng)供應充足，使得植株生長發(fā)育得更好。因此，與單接種AMF或者根瘤菌相比，雙接種技術具有更明顯的優(yōu)勢。