馬鈴薯枯萎病拮抗菌的篩選與鑒定

李彩虹， 楊志輝， 張 岱， 趙冬梅， 潘 陽， 朱杰華

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071000)

馬鈴薯枯萎病是由茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、接骨鐮刀菌5種不同的鐮刀菌寄生所引起的一種真菌土傳病害[1]，分布廣泛，在我國各種植區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病率達(dá)15%～45%[2]。近年來，隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的實(shí)施，馬鈴薯種植面積逐年擴(kuò)大，由此帶來的連作重茬導(dǎo)致馬鈴薯枯萎病日益加重，一般造成減產(chǎn)30%，嚴(yán)重時(shí)可造成78%的植株死亡，直接影響了馬鈴薯產(chǎn)量及其經(jīng)濟(jì)效益，嚴(yán)重制約了我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。

目前，馬鈴薯枯萎病的防治措施主要以農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)藥劑拌種為主，但由于該病為土傳病害，其病原菌抗逆性強(qiáng)且對(duì)植株為系統(tǒng)性侵染，使用藥劑防治效果較差，使用藥劑進(jìn)行大面積的土壤處理可行性較小[3]。在缺乏有效化學(xué)藥劑和抗病品種的前提下，利用拮抗菌防治枯萎病是防治途徑之一，并且生防菌對(duì)環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全，具有改善環(huán)境、獲得長期效益作用，符合現(xiàn)階段植物病害控制的發(fā)展方向[4]。

芽孢桿菌可以形成耐高溫、輻射、高酸堿等逆境的芽孢，能夠產(chǎn)生脂肽類和蛋白類等抗真菌物質(zhì)，具有廣譜抗真菌活性和良好的穩(wěn)定性，越來越為人們所關(guān)注。普遍認(rèn)為芽孢桿菌生防機(jī)制主要有營養(yǎng)和空間位點(diǎn)競爭、抗菌物質(zhì)產(chǎn)生、溶菌作用、誘導(dǎo)植物抗病性等[5]。目前，利用芽孢桿菌有益菌株拮抗植物鐮刀菌病害的研究已有較多報(bào)道，如黃瓜枯萎病[6]、香蕉枯萎病[7]、西瓜枯萎病[8]以及馬鈴薯干腐病[9]等，但針對(duì)馬鈴薯枯萎病開展的拮抗芽孢桿菌篩選的研究尚不多見，因此，進(jìn)一步篩選出適合我國不同區(qū)域的芽孢桿菌菌株對(duì)于防治馬鈴薯枯萎病具有重要意義。

本研究從16個(gè)馬鈴薯枯萎病發(fā)生地塊的健康植株根際分離篩選出6株對(duì)馬鈴薯枯萎病病原菌有極強(qiáng)抗性的芽孢桿菌菌株，并對(duì)其中NZ-4菌株的抑菌譜進(jìn)行了測定，旨在為馬鈴薯枯萎病的生物防治以及生防菌劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

從河北省保定、承德、張家口、秦皇島以及內(nèi)蒙古自治區(qū)、貴州省的馬鈴薯枯萎病發(fā)病田塊中采集健康植株的根際土壤，采集深度范圍為10～20 cm，用無菌自封袋封好后帶回實(shí)驗(yàn)室，暫保存于4 ℃，用于分離拮抗菌。

1.2 靶標(biāo)病原菌

1株尖鐮孢馬鈴薯?；途?Fusariumoxysporumf.sp. tuberosi，Y10-2)，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌為LB培養(yǎng)基[10]，真菌為PDA培養(yǎng)基[11]。

1.4 芽孢桿菌菌株的分離和純化

采用熱處理土壤稀釋法[12]分離芽孢桿菌，連續(xù)劃線培養(yǎng)至純，以體積比1 ∶1混合于70%甘油中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 拮抗菌的篩選

采用平板對(duì)峙法[13]測定芽孢桿菌對(duì)尖孢鐮刀菌Y10-2的拮抗作用。初篩采用抑菌帶法，將接種平皿置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以只接種病原菌的PDA平板為對(duì)照，待對(duì)照長滿平皿時(shí)，測量抑菌帶寬度并篩選出抑菌效果較好的菌株，采用抑菌圈法進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

1.6 拮抗菌株的鑒定

采用菌落形態(tài)、革蘭氏染色與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)篩選到的拮抗菌株進(jìn)行鑒定。

gyrB基因的序列分析：正向引物gyrB-F為5′-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3′；反向引物gyrB-R為5′-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3′[14]。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳上檢測后，送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測序。將所測序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用Clustalx和MEGA 6.0[15]軟件對(duì)分離芽孢桿菌及模式菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.7 拮抗菌抑菌譜測定

采用對(duì)峙培養(yǎng)法測定拮抗菌株對(duì)馬鈴薯炭疽病、馬鈴薯瘡痂病、小麥根腐病菌、梨黑斑病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、番茄早疫病菌、紅腐病菌以及煙草疫霉菌等重要的農(nóng)業(yè)病害病原真菌的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離及拮抗菌株的篩選

從16份根際土壤中分離純化到對(duì)馬鈴薯枯萎病菌具有潛在拮抗作用的芽孢桿菌有288株。通過平板對(duì)峙法初篩獲得抑菌帶寬度≥3 mm的拮抗菌株188株，占所有菌株的 65.3%。其中，20株拮抗菌抑菌帶寬度達(dá)到5.7 mm以上。利用抑菌圈法繼續(xù)對(duì)20株拮抗菌進(jìn)行復(fù)篩，獲得抑菌圈直徑>20.0 mm的拮抗菌6株(表1、圖1)。

2.2 芽孢桿菌的種類鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 拮抗菌菌落呈圓形、乳白色，菌落邊緣不整齊、表面有突起或褶皺，具有一定的粘附性，直徑為5 mm左右；4 d后可產(chǎn)生棕褐色色素。6株拮抗菌根據(jù)其菌落形態(tài)具體又可分為3類：NZ-4菌株為第1類，菌落中間為突起狀，邊緣褶皺明顯，顏色較暗；NZ-5、NZ-6、HC-Z-18為第2類，菌落中間突起部分有凹陷，似噴泉狀，邊緣較為整齊；HC-Y-5、HC-Y-16為第3類，菌落中間凹陷，似魚嘴狀，邊緣褶皺明顯，不整齊。6株拮抗菌菌體均為桿狀，長約 2 μm，單生，革蘭氏染色結(jié)果為陽性(圖2)。

表1 芽孢桿菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

2.2.2 拮抗菌gyrB基因序列分析 測定了NZ-4等6個(gè)芽孢桿菌菌株的gyrB基因序列，其序列相同，為1個(gè)haplotype，長度為964～999 bp。將該序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast，并下載相似性高于98%的序列8條。以Bacillussubtilis(枯草芽孢桿菌)等為外群，同源序列比對(duì)后，獲得長度為 892 bp 的gyrB基因數(shù)據(jù)組，利用鄰接法構(gòu)建了6個(gè)未知芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。該樹形成1個(gè)大分支，即解淀粉芽孢桿菌復(fù)合種，該大分支可分為3個(gè)末端分支，從上到下分別為Bacillusvelezensis、Bacillusamyloliquefaciens和解淀粉芽孢桿菌中的另外1個(gè)隱藏種。本研究中的6條序列均聚在第1個(gè)分支，將其鑒定為Bacillusvelezensis。

2.3 拮抗菌NZ-4的抑菌譜

將菌株NZ-4對(duì)8株病原菌株進(jìn)行抑菌譜測定。結(jié)果顯示，菌株NZ-4對(duì)馬鈴薯炭疽病、瘡痂病的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到35 mm； 對(duì)小麥根腐病菌、梨黑斑病菌、蘋果斑點(diǎn)落葉病菌、番茄早疫病菌的抑菌圈直徑均在24 mm以上；對(duì)紅腐病菌也有一定的拮抗作用；但對(duì)煙草疫霉菌的拮抗作用不明顯(表2、圖4)。表明菌株NZ-4有比較廣的抑菌譜，可以考慮將其應(yīng)用于除馬鈴薯枯萎病外的其他作物病害的生防研究。

3 討論

采用gyrB序列對(duì)比方法對(duì)NZ-4等6株芽孢桿菌菌株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，并結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)觀察將它們鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。系統(tǒng)發(fā)育分析主要依據(jù)與6株拮抗菌gryB基因序列同源性為99%的 DQ903176(GenBank登錄號(hào))，該菌株同KY315726、KM603514和KR605463單獨(dú)聚為1個(gè)分支。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是2005年由Ruiz-García等新命名的芽孢桿菌種[16]，DQ903176菌株屬于Bacillusvelezensis，該菌之前被認(rèn)定為Bacillusamyloliquefaciens的后異形同義詞[17]，2015年，Dunlap等通過對(duì)BacillusvelezensisNRRL B-41580T進(jìn)行比較基因組學(xué)和DNA-DNA雜交分析，否定了Bacillusvelezensis為Bacillusamyloliquefaciens的后異形同義詞，即Bacillusvelezensis為不同于Bacillusamyloliquefaciens的一個(gè)種[18]。因此，本研究將登錄號(hào)為DQ903176的菌株所在的分支界定為Bacillusvelezensis種群，并將6株拮抗菌鑒定為Bacillusvelezensis。

表2 拮抗菌株NZ-4對(duì)不同病原菌拮抗效果

貝萊斯芽孢桿菌是一種新型生防細(xì)菌，有關(guān)它的研究日益增多。有研究發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌[19]、番茄灰霉病灰葡萄孢菌[20]等具有拮抗活性，該菌產(chǎn)生的β-葡聚糖酶可抑制楊樹紫紋羽病菌[21]，還有研究者將該菌制成生物制劑，可有效降低赤霉病和DON積累[22]。本研究從16個(gè)馬鈴薯種植地塊分離篩選得到6株貝萊斯芽孢桿菌，它們對(duì)馬鈴薯枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌都具有很強(qiáng)的拮抗活性，為貝萊斯芽孢桿菌在馬鈴薯枯萎病的生物防治上提供了新的科學(xué)依據(jù)。

芽孢桿菌的拮抗機(jī)制通常是由于它能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)[23-24]。芽孢桿菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要有細(xì)菌素、抗生素、細(xì)胞壁溶解酶、其他抑菌蛋白及揮發(fā)性抗菌物質(zhì)等[25]。相關(guān)研究表明，芽孢桿菌產(chǎn)生的fengycin類和iturin類家族的脂肽類化合物在抑制真菌病害中起著重要作用，這些物質(zhì)中的一些只抗相同或相近的有特異受體位點(diǎn)的種類[26]。Lee等研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的bacillomycin D、fengycin和(oxy) difficidin等活性物質(zhì)抑制病原菌[27]。本研究結(jié)果表明，NZ-4菌株對(duì)除馬鈴薯枯萎病以外的其他多種重要農(nóng)業(yè)病害病原菌也能產(chǎn)生較強(qiáng)的拮抗作用，由此推測，NZ-4菌株可能產(chǎn)生多種不同的抑菌物質(zhì)，亦或該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)有較廣的抑菌能力，具體活性物質(zhì)成份還有待于進(jìn)一步研究，以期為該菌株在生產(chǎn)實(shí)踐中更廣泛的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。