10個(gè)DNA分子標(biāo)記在小麥抗條銹病輔助育種上的應(yīng)用

張成兵， 劉青利， 張先平， 李 云， 邢麗紅， 張 羽

(1.陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西漢中 723000； 2.陜西省渭南市臨渭區(qū)種子管理站，陜西渭南 714000；3.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000)

條銹病是由條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf. sp.tritici)引起的小麥葉部病害，是世界上小麥的主要真菌病害，也是我國(guó)小麥生產(chǎn)中重要的病害之一，在我國(guó)曾多次大流行[1]。防治小麥條銹病主要通過使用化學(xué)農(nóng)藥和種植抗性品種2種途徑，化學(xué)防治通常成本高、污染環(huán)境且殘留的成分危害人類健康。因此，發(fā)掘新的優(yōu)良抗條銹病基因及其緊密連鎖的分子標(biāo)記，培育持久高抗病品種具有經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保等重要意義。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，相繼開發(fā)了一些與條銹病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，利用已知抗條銹病基因的分子標(biāo)記，可以從DNA水平上對(duì)育種材料進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)和評(píng)價(jià)，進(jìn)而明確小麥品種中抗性基因的分布，為高效開展條銹病抗性基因聚合育種帶來了新的契機(jī)。Chen等篩選到了與抗性基因Yr5緊密連鎖的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplification polymorphism DNA，簡(jiǎn)稱RAPD)和簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat，簡(jiǎn)稱SSR)標(biāo)記[2]。Weng等篩選到了與Yr9緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xgwm582(3.7 cM)和Xgwm264(37.9 cM)[3]。邵映田等在Yr10的供體親本Moro中篩選到與Yr10緊密連鎖的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplification fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱AFLP)標(biāo)記[4]。Peng等研究了與抗條銹病基因YrH52、Yr15連鎖的分子標(biāo)記[5]。劉亞萍在小麥1BS上篩選到Y(jié)r24的SSR標(biāo)記Xgwm11(6.1 cM)和Xgwm273(7.1 cM)[6]。嚴(yán)俊等在抗病材料H52中篩選到抗性連鎖的抗性基因類似物(resistance gene analogue，簡(jiǎn)稱RGA)分子標(biāo)記[7]。殷貴鴻等從小麥抗條銹病骨干親本周8425B中篩選得到與抗性基因緊密連鎖的片段長(zhǎng)度為343 bp的抗病基因類似序列多態(tài)性分子標(biāo)記技術(shù)(resistance gene analogue polymorphism,簡(jiǎn)稱RGAP)標(biāo)記Xrga-1[8]。李嘉從濟(jì)麥22/Avocet S和濟(jì)965261中分別找到了抗條銹病基因的連鎖SSR標(biāo)記Xwmc658、Xgwm582[9]。朱曉娜等篩選到抗條中32號(hào)小種(CYR32)的特異RAPD標(biāo)記S20[10]。目前，已有57個(gè)抗條銹病基因被正式命名，編號(hào)從Yr1到Y(jié)r54(其中有等位基因)，以第1個(gè)抗條銹病基因Yr10為代表的數(shù)個(gè)基因被克隆。但生產(chǎn)中由于大面積種植單一小麥品種，致使條銹菌在定向的選擇壓力下迅速變異，并引起優(yōu)勢(shì)小種種群的增長(zhǎng)和小麥條銹菌新小種的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致一個(gè)抗銹品種在生產(chǎn)上能大面積應(yīng)用的時(shí)間較短，隨著其原有抗銹性的喪失而失去應(yīng)用價(jià)值，特別是新的條銹菌生理小種條中32(CYR32)和條中33(CYR33)的出現(xiàn)和蔓延，導(dǎo)致多數(shù)主栽品種失去抗性。目前，對(duì)CYR32和CYR33表現(xiàn)抗性的主效基因僅剩Yr5、Yr15、Yr24、Yr26(與Yr24等位)、YrH52、YrZH84等。李在峰用26個(gè)國(guó)內(nèi)外條銹菌生理小種對(duì)98個(gè)我國(guó)小麥品種(系)進(jìn)行苗期基因推導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)攜帶Yr9基因的材料占43%，其次為Yr26基因[11]。伍玲等檢測(cè)了2004、2005年四川省小麥區(qū)域試驗(yàn)72份材料中抗條銹基因Yr5、Yr10、Yr15的分布情況，攜帶Yr15基因的材料最多，占11.11%，其次為Yr5基因，占5.56%，再次為Yr10基因，占 1.34%[12]。李峰奇等對(duì)126份我國(guó)黃淮麥區(qū)重要的小麥品種(系)進(jìn)行抗條銹病基因分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)攜帶Yr9基因的小麥品種頻率最高，為41.6%，其次是Yr5、Yr10、Yr15、Yr26基因[13]。張勝利等用不同材料檢測(cè)抗性基因Yr5-156、Yr9-2、Yr24-1在不同材料中的分布情況，發(fā)現(xiàn)在感性材料中也能擴(kuò)增出和抗病材料同樣的特異性目標(biāo)條帶[14-16]。王欣等對(duì)青海省育成和引進(jìn)的137份小麥品種進(jìn)行Yr10、Yr15基因的特定序列擴(kuò)增區(qū)域(sequence characterized amplified regions，簡(jiǎn)稱SCAR)標(biāo)記和SSR標(biāo)記以及1BL/1RS易位的復(fù)合標(biāo)記進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示1BL/1RS易位占參試材料的16.1%，其次為Yr15基因，占13.9%，再次為Yr10基因，占2.9%[17]。薛文波等對(duì)74個(gè)主栽小麥品種進(jìn)行了連續(xù)2年的成株期抗病性鑒定結(jié)合抗性基因檢測(cè)，攜帶Yr9基因的占32.43%，攜帶Yr26基因的占6.76%，攜帶Yr17基因的占5.41%，74個(gè)供試材料中未檢測(cè)到Y(jié)r5、Yr10、Yr15、Yr18基因[18]。張玉薇等利用Yr10、Yr18基因以及1BL/1RS易位的SCAR或STS標(biāo)記在75份2006—2010年國(guó)家審定的小麥品種中的分子檢測(cè)顯示，攜帶Yr10基因的占17.33%，攜帶Yr18基因的占1.33%，1份材料中同時(shí)檢測(cè)到Y(jié)r10+Yr18基因組合，25份材料中含有 1BL/1RS 易位片段[19]。李敏州等對(duì)115份陜西省主栽和后備小麥品種(系)進(jìn)行抗性基因檢測(cè)，結(jié)果顯示攜帶Yr9基因的占35.65%，攜帶Yr5基因的占2.61%，攜帶Yr18基因的占 2.61%，攜帶Yr26基因的占1.74%，115份材料中均不含Yr10基因[20]。徐琪等構(gòu)建了檢測(cè)Yr1、Yr2基因的分子標(biāo)記gwm372和gwm382，并用此檢測(cè)來自我國(guó)各麥區(qū)的181份小麥高代系材料，結(jié)果顯示Yr1、Yr2基因在181份小麥高代系材料中占比較低[21]。陳天青等調(diào)查了140份2013—2014年西南地區(qū)主要的小麥種質(zhì)資源中幾個(gè)抗銹病基因的分布情況，顯示攜帶Yr26基因的占41.4%，其次為Yr9基因，占37.9%，Yr10、Yr15、Yr18基因占比較低，Yr9+Yr26基因組合出現(xiàn)的頻率較高[22]。孫建魯?shù)葘?duì)100個(gè)小麥品種資源抗條銹病基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr18、Yr24、Yr26的檢測(cè)結(jié)果顯示，攜帶Yr18基因的占19.00%，攜帶Yr10基因的占4.00%，攜帶Yr15基因的占2.00%，攜帶Yr5基因的占1.00%，供試材料中均不含Yr24、Yr26基因[23]。李北等對(duì)重慶地區(qū)的18份當(dāng)?shù)刂髟云贩N和89份高代品系材料進(jìn)行了7個(gè)已知抗條銹基因的分子檢測(cè)，供試材料中攜帶Yr26基因的最多，占 36.45%，其次為Yr9基因，占19.63%，攜帶Yr17基因的占15.89%，攜帶Yr18基因的占2.80%，沒有檢測(cè)到含Yr5、Yr10、Yr15基因的材料[24]。黃亮等對(duì)我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)的79個(gè)小麥品種(系)進(jìn)行抗條銹病基因檢測(cè)，結(jié)果表明供試小麥品種中1B/1R易位的占44.3%，攜帶Yr10基因的占10.1%，攜帶Yr5基因的占5.1%，攜帶Yr18基因的占3.8%，攜帶Yr26基因的占1.3%[25]。白微微等檢測(cè)46份新疆麥區(qū)小麥材料中Yr10基因及1BL/1RS易位的分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn) 1BL/1RS 易位的占19.57%，攜帶Yr10基因的占2.20%[26]。我國(guó)小麥品種中抗條銹基因過于單一，在我國(guó)條銹病流行區(qū)主栽品種中，有效抗源主要集中在92R系列(攜帶Yr26)、貴農(nóng)系以及少數(shù)攜帶Yr24的國(guó)際玉米小麥改良中心(centro internacional de mejoramientode maizy trigo，簡(jiǎn)稱CIMMYT)抗源種質(zhì)[27]。

本研究以陜西省漢中地區(qū)大面積種植品種漢麥5號(hào)(漢5)和漢麥6號(hào)(漢6)為母本，以抗源品種貴農(nóng)22中選出的一個(gè)品系為父本進(jìn)行雜交，以多代定向選擇選育出的高代品系為供試材料，通過檢測(cè)與Yr5、Yr9、Yr15等基因連鎖的分子標(biāo)記在供試材料中的分布情況，以期為新品種(系)的抗性遺傳基礎(chǔ)鑒定及持久抗性材料選育提供技術(shù)支撐。同時(shí)，選取與Yr9基因遺傳距離不同的2個(gè)連鎖分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證分子標(biāo)記與目標(biāo)基因之間是否發(fā)生交換。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料45份，其中陜西省漢中地區(qū)大面積種植品種6份(漢5、漢6、D002、川麥42、9503、川麥107)，漢5與貴農(nóng)22雜交后選育的高代品系4份(漢5-1、漢5-2、漢5-3、漢 5-4)，漢6與貴農(nóng)22雜交后選育的高代品系32份(漢6-1至漢6-32)，育種材料2份[貴農(nóng)22-1、貴農(nóng)22(病圃)]，抗銹性鑒定誘發(fā)品種1份(銘賢169)，所有材料均由陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及PCR 小麥基因組DNA采用十二烷基苯磺酸鈉(SDS)法提取，并采用0.8%瓊脂糖凝膠檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量。PCR反應(yīng)體系：2×TaqMaster Mix 15 μL，10 μmol/L正反引物各1 μL，DNA模板1 μL，反應(yīng)總體積為30 μL，用ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性50 s，x℃(此溫度根據(jù)引物而定)退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，用銀染法顯色拍照。

1.2.2 引物信息 抗性基因的引物信息如表1所示，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

Yr5基因的特異引物Yr5-156擴(kuò)增的目標(biāo)帶大小在 156 bp 左右[2]。由圖1可知，以100 bp DNA Marker為對(duì)照，攜帶Yr5基因的材料在156 bp左右均能擴(kuò)增出特征性條帶，反之則沒有條帶。

表1 引物信息

注：“？”代表遺傳距離不清楚。

由表2可知，在45份供試小麥材料中，42份材料檢測(cè)出Yr9-2基因，占93.33%；38份材料檢測(cè)出Yr5基因，占 84.44%；13份檢測(cè)出Yr10基因，占28.89%；16份檢測(cè)出YrH52基因，占35.56%；21份檢測(cè)出YrZH84基因，占 46.67%；17份材料檢測(cè)出Yr24基因，占37.78%；36份材料檢測(cè)出Yr9-1基因，占80.00%；26份材料檢測(cè)出YrJ22基因，占57.78%；18份材料檢測(cè)出S20標(biāo)記，占40.00%。供試材料中，攜帶最多的為Yr9-2基因，其次為Yr5基因，所有材料中均不含Yr15基因。

由表3可知，與抗小麥條銹病有關(guān)的10個(gè)DNA分子標(biāo)記檢測(cè)中，其中同時(shí)在1個(gè)材料中檢測(cè)到4個(gè)抗性DNA標(biāo)記的最多，占22.22%；含有9個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的材料只有漢6-31，占供試材料的2.2%；含有8個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的材料有5份，分別為漢6、漢5-1、漢6-16、漢6-24、漢6-25，占供試材料的 11.1%?？梢娺@些材料除不含對(duì)CYR32、CYR33表現(xiàn)抗性的主效基因Yr15外，其他基因如Yr5、Yr24、Yr26、YrH52、YrZH84等均存在，這些材料可以在育種及生產(chǎn)中廣泛推廣應(yīng)用，尤其是漢6-31，可以加大該主栽品種的推廣力度。

3 討論與結(jié)論

本研究采用與小麥抗條銹病基因連鎖的10個(gè)分子標(biāo)記對(duì)45份陜西省漢中地區(qū)主要小麥種質(zhì)資源進(jìn)行檢測(cè)，銘賢169在小麥抗條銹病基因的圖位克隆定位中常被用來作為感病品種，本研究檢測(cè)的10個(gè)分子標(biāo)記在銘賢169中均沒有檢測(cè)到，可以看出試驗(yàn)結(jié)果可信度較高。張勝利等用Yr5、Yr9基因抗性標(biāo)記對(duì)小麥條銹病表現(xiàn)不同的抗感材料檢測(cè)時(shí)，在感性材料中發(fā)現(xiàn)也能擴(kuò)增出和抗病材料同樣的特異性目標(biāo)條帶，一方面暗示了抗病表型與基因關(guān)系的復(fù)雜性，不是簡(jiǎn)單的一對(duì)一關(guān)系，另一方面可能由于標(biāo)記與基因之間沒有達(dá)到完全的共分離程度，導(dǎo)致標(biāo)記與目的基因之間發(fā)生了交換[14-15]。本研究利用與Yr9基因連鎖(Xgwm264-Xgwm582-Yr9)的遺傳距離不同的2個(gè)標(biāo)記(Xgwm582、Xgwm264)同時(shí)檢測(cè)，從結(jié)果可以看出，用來檢測(cè)Yr9基因的2個(gè)分子標(biāo)記結(jié)果有所差異，有的材料可能在Xgwm264與Yr9基因之間發(fā)生了交換。如果以與Yr9基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記Xgwm582為依據(jù)，在45份供試小麥材料中，Yr5基因的檢出率最高，其次為Yr9-1(Xgwm582)基因，說明攜帶Yr5、Yr9基因的材料是目前陜西省漢中地區(qū)小麥種質(zhì)資源中的有效抗源，這與Yr9基因曾廣泛應(yīng)用于小麥抗條銹病育種有關(guān)。來源于野生二粒小麥的抗性基因Yr15、YrH52雖然都被定位在染色體1BS上，但本研究檢測(cè)Yr15、YrH52基因的不一致結(jié)果也與Peng等推測(cè)其為2個(gè)不同的基因[5]一致。貴農(nóng)22是陜西省漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所在全國(guó)小麥品種抗病性變異觀察圃(漢中點(diǎn))中選出的一個(gè)抗源材料，韓德俊等也曾報(bào)道，在目前我國(guó)條銹病流行區(qū)主栽品種中，有效抗源主要集中在92R系列(攜帶Yr26基因)、貴農(nóng)系和少數(shù)攜帶Yr24基因的CIMMYT抗源種質(zhì)[27]。貴農(nóng)22作為抗源材料之一， 與漢中麥區(qū)的主栽品種雜交，選育抗條銹病的小麥新品種與新材料具有很好的實(shí)踐意義，本研究的結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，在選育的高代品系中含有8個(gè)及以上分子標(biāo)記位點(diǎn)的材料有6份，這為以后的選育工作奠定了基礎(chǔ)。

表2 抗條銹病基因在供試材料中的分布情況

注：“+”代表檢測(cè)到特定條帶，“-”代表未檢測(cè)到特定條帶。

表3 供試材料攜帶的抗性標(biāo)記位點(diǎn)數(shù)目

在小麥抗條銹病的分子標(biāo)記開發(fā)中，很多標(biāo)記是基于特定材料而構(gòu)建的，其變異位點(diǎn)不一定適合對(duì)所有小麥資源進(jìn)行抗感檢測(cè)，在其功能標(biāo)記未探明前，往往與目標(biāo)基因有多個(gè)連鎖標(biāo)記，在分子標(biāo)記輔助育種進(jìn)行選擇時(shí)應(yīng)選擇遺傳距離最小的標(biāo)記，同時(shí)應(yīng)盡量把分子標(biāo)記檢測(cè)與田間抗病性鑒定結(jié)合起來共同篩選抗性資源。另外，由于新的抗條銹病生理小種的出現(xiàn)，在小麥抗條銹病育種中應(yīng)不斷發(fā)掘、擴(kuò)增新的小麥條銹病抗源，以培育新的優(yōu)勢(shì)抗病品種。