關(guān)嶺牛pEGFP-N3-UCP3重組真核表達(dá)載體的構(gòu)建

代振新 ，陳 偉 ，2，3，4，韓 雪 ，許厚強(qiáng) ，2，3，吳國文 ，申 勇 ，熊元松

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025；5.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550025）

線粒體解偶聯(lián)蛋白3（uncoupling proteins 3，UCP3）是UCP家族中分布最廣泛、表達(dá)最廣泛的成員[1]。至今為止，哺乳動(dòng)物體內(nèi)已識(shí)別出5種解偶聯(lián)蛋白， 分別為 UCP1、UCP2、UCP3、BMCP1/UCP4 和 UCP5[2]。 UCPs是完整的線粒體內(nèi)膜的膜蛋白，其功能是作為質(zhì)子運(yùn)載體，使跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度消失（稱為“質(zhì)子漏”），ADP不能進(jìn)行磷酸化生成ATP，結(jié)果是物質(zhì)氧化與ATP生成脫偶聯(lián)而成為產(chǎn)熱過程，UCPs在生熱中起著重要的作用[3]。UCP3主要在骨骼肌中表達(dá)，在褐色脂肪組織和心肌中也有少量表達(dá)[4]。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)UCP3基因開展了廣泛研究，結(jié)果表明，UCP3基因表達(dá)具有組織特異性[5]，肌肉UCP3過表達(dá)模仿耐力訓(xùn)練將減少不徹底β-氧化的循環(huán)生物標(biāo)志物[6]。UCP3參與產(chǎn)熱過程，也可對(duì)線粒體呼吸起解偶聯(lián)作用，主要功能是調(diào)節(jié)脂肪酸代謝和減少活性氧的產(chǎn)生[7]。UCP3蛋白具備的生理、生化重要作用顯示它是參與骨骼肌能量代謝的重要靶蛋白，對(duì)與機(jī)體能量平衡相關(guān)的肥胖、靜止代謝率以及體脂代謝等作用的調(diào)控具有顯著影響[8]。關(guān)嶺牛適宜于山區(qū)放牧，以體質(zhì)健壯、肉質(zhì)良好、耐粗飼、易管理、適應(yīng)山地環(huán)境而著稱，是山區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要的使役動(dòng)物[9]。同時(shí)，關(guān)嶺牛養(yǎng)殖也是帶動(dòng)山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、促進(jìn)農(nóng)民增收的重要途徑。因此，該試驗(yàn)以關(guān)嶺牛為研究對(duì)象，從關(guān)嶺牛UCP3基因的啟動(dòng)子入手，將其與不含CMV區(qū)的pEGFP-N3片段平末端連接，構(gòu)建pEGFP-N3-UCP3重組質(zhì)粒，為今后進(jìn)一步探究UCP3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。

圖1 UPC3啟動(dòng)子片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

pEGFP-N3綠色熒光蛋白載體由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶、DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、高保真DNA聚合酶、dNTP購于鼎國公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增UCP3啟動(dòng)子：根據(jù)GenBank中公布的牛UCP3（NM_174210）基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)牛UCP3基因5′端加磷的引物，上游引物序列為5′-TACCCTCAGTGCCTATCA-3′， 下游引物序列為 5′-GCCATTTGCTGGTGTCT-3′，引物由恒因生物技術(shù)有限公司合成。以關(guān)嶺牛血液基因組DNA為模板擴(kuò)增UCP3啟動(dòng)子，PCR擴(kuò)增體系為20 μL。PCR條件為：98℃預(yù)變性 3 min；98℃變性 10 s，59℃退火 30 s；72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 PCR擴(kuò)增不含CMV區(qū)的pEGFP-N3載體片段：以pEGFP-N3質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物序列為：5′-GCTAGCGCTACCGGACTCAGAT-3′，下游引物序列為：5′-ATTAATAACTAATGCATGGCGG-3′。 PCR 總反應(yīng)體系為 20 μL。 PCR擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，59℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，10個(gè)循環(huán)；98℃變性 10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；12℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝電泳檢測PCR產(chǎn)物[10]。

圖2 不含啟動(dòng)子區(qū)的pEGFP-N3載體片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1.2.3 構(gòu)建不含CMV區(qū)的pEGFP-N3-UCP3重組表達(dá)載體：將PCR獲得的UCP3啟動(dòng)子片段用膠回收試劑盒回收純化。將膠回收產(chǎn)物與不含CMV區(qū)的pEGFP-N3片段平末端連接，16℃連接過夜，經(jīng)轉(zhuǎn)化后挑取5～6個(gè)單菌落分別接種于5 mL含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)12～16 h，菌液經(jīng)PCR鑒定后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 UCP3基因啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增

以提取的關(guān)嶺牛血液基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1 080 bp處出現(xiàn)條帶，與目的條帶大小一致（見圖1）。

2.2 擴(kuò)增不含CMV區(qū)的pEGFP-N3載體片段

以pEGFP-N3空質(zhì)粒為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增不含CMV啟動(dòng)子的pEGFP-N3載體片段，結(jié)果顯示，獲得的片段大小與目的條帶一致（見圖2）。

2.3 重組載體pEGFP-N3-UCP3的鑒定

對(duì)陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR鑒定，產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小為1 080 bp，與預(yù)期片段大小一致，而陰性對(duì)照則沒有目的片段出現(xiàn)（見圖3）。PCR檢測后送測序，測序比對(duì)結(jié)果與原序列一致（見圖4），表明UCP3啟動(dòng)子替代CMV啟動(dòng)子的重組載體pEGFP-N3-UCP3構(gòu)建成功。

圖3 陽性重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定結(jié)果

3 討論

研究表明，在蛋白水平，UCP3是唯一在骨骼肌中表達(dá)的解耦聯(lián)蛋白，這使得UCP3受到很多研究者的關(guān)注。當(dāng)進(jìn)入線粒體的脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）超過其β-氧化能力時(shí)，UCP3可以從線粒體基質(zhì)中輸出脂肪酸陰離子或脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，從而防止脂肪酸或脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物在線粒體內(nèi)堆積而引起損傷，并促進(jìn)脂肪酸的代謝。另外，UCP3可以減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，從而阻止或減少氧化性破壞[11]。近期研究發(fā)現(xiàn)，距離UCP3基因啟動(dòng)子上游1 500個(gè)堿基對(duì)的一個(gè)區(qū)域可驅(qū)動(dòng)褐色脂肪組織特異性表達(dá)。當(dāng)嚙齒類動(dòng)物處于寒冷的環(huán)境中 （非顫抖寒冷誘導(dǎo)的生熱）或攝入過量食物（促進(jìn)膳食誘導(dǎo)的生熱）時(shí)，褐色脂肪組織起重要的作用[3]。近年來，國內(nèi)學(xué)者針對(duì)南陽牛[12]和中國西門塔爾牛[13]UCP3 基因多態(tài)性與生長和育肥性狀的關(guān)聯(lián)開展了一些研究，證實(shí)其可作為牛早期選育的有效標(biāo)記，并建議將UCP3基因作為肉牛生長及育肥性狀的候選基因，用于肉牛的標(biāo)記輔助育種。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了不含CMV啟動(dòng)子區(qū)的重組真核表達(dá)載體pEGFP-N3-UCP3，為UCP3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖4 測序比對(duì)結(jié)果