豬流行性腹瀉診斷方法研究進(jìn)展

王 婧 ，刁小龍 ，牛蒙蒙 ，陳曉蘭 ，張 龍

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.中崇信諾生物科技泰州有限公司，江蘇 泰州 225300）

1 豬流行性腹瀉

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）主要引起斷奶仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水等癥狀，與傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）同屬于冠狀病毒，二者均可引起豬腸道性傳染病[1]。PEDV可感染多個(gè)年齡段的豬，尤其對仔豬的傳染性較普遍。仔豬感染PEDV后死亡率較高，1周齡的仔豬可在發(fā)生腹瀉后的4～5 d出現(xiàn)嚴(yán)重脫水從而導(dǎo)致死亡，死亡率高達(dá)50%，最高可達(dá)到100%。該病的主要傳播途徑是經(jīng)消化道傳播，病豬是主要的傳染源。PEDV隨糞便排出，傳染速度較慢，通常在4～5周內(nèi)傳染整個(gè)豬場。由于該病的發(fā)病率較高，每年都會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)豬行業(yè)的巨大損失。

圖1 病豬腸壁薄，腸內(nèi)部出現(xiàn)黃色水樣稀糞和黃色乳凝塊[3]

1.1 流行病學(xué)特點(diǎn)

豬流行性腹瀉的發(fā)生有明顯的季節(jié)性，通常于冬季12月至第2年的2月發(fā)病，有時(shí)夏季也會(huì)發(fā)病。該病易感染各種日齡的豬，哺乳期、斷奶期和育肥期豬感染率達(dá)15%～90%，仔豬的死亡率在50%，日齡越小被感染的概率越大。斷奶豬、育肥豬感染該病后癥狀比較輕，成年豬則主要表現(xiàn)為嘔吐和厭食等癥狀[2]。自20世紀(jì)80年代國內(nèi)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)流行性腹瀉病毒至今，該病毒的感染率在我國呈現(xiàn)逐年升高的態(tài)勢，雖然在一定程度上疫苗起到了一定的保護(hù)作用，但是在2010年之后，該病在我國有了死灰復(fù)燃的趨勢。

1.2 病理變化

感染PEDV的病豬發(fā)病前期腹瀉主要排黃色黏稠便，后期為水樣便并伴有精神不振[1]。病豬小腸擴(kuò)張，腸內(nèi)容物為黃色液體（見圖1）或呈泡沫狀，腸壁變薄（見圖2）、變透明。小腸絨毛顯著縮短。部分病豬胃呈空虛狀態(tài)，或者充滿黃色液體。

2 病原檢測技術(shù)

2.1 病毒分離與鑒定

病毒分離鑒定技術(shù)是檢測畜禽病毒的主要方法，也是最切實(shí)可行的方法[4]，收集病變豬空腸和腸內(nèi)容物，用加有雙抗的PBS（磷酸鹽緩沖液）配成5倍懸液離心，將離心后的上清液用微孔濾膜過濾，依照一定的比例在單層Vero細(xì)胞上接種，放置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3～4 d，觀察細(xì)胞病變[5]。 感染 PEDV 的Vero細(xì)胞最明顯的病變特征是細(xì)胞融合，形成多核體，并最終凋亡脫落。另外，也可將PEDV接種鴨小腸上皮細(xì)胞系，在胰酶存在的情況下病毒能夠迅速繁殖。

2.2 免疫電鏡觀察

圖2 病豬腸壁變薄[3]

免疫電鏡技術(shù)是在超微結(jié)構(gòu)水平上用來研究和觀察抗原、抗體結(jié)合定位的一種方法，是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。PEDV和TGEV都可引起各種年齡豬腹瀉，兩者同為冠狀病毒屬且借助普通電鏡無法區(qū)分。免疫電鏡能夠準(zhǔn)確地診斷病原體，可用已知的PEDV抗原檢測未知抗體。該方法也可用于區(qū)分PEDV和同屬冠狀病毒科的其他病毒[6]。將含有抗原和抗體的溶液或血清離心，將2種溶液等量混合，37℃培養(yǎng)30 min，然后轉(zhuǎn)移到恒溫箱，然后再次離心樣品，對沉淀物進(jìn)行染色，放在免疫電鏡下觀察，可以觀察到由病毒粒子形成的免疫復(fù)合物。電鏡觀察結(jié)果表明兩者在形態(tài)上存在有細(xì)微差異，即豬流行性腹瀉病毒粒子大小變化不一，呈多形性，纖突短小而密集，核芯呈多形性；豬傳染性胃腸炎病毒粒子大小較均一，呈圓形或呈橢圓形，纖突大而稀疏，核芯為環(huán)形[7]。

3 免疫學(xué)診斷技術(shù)

免疫學(xué)診斷技術(shù)是根據(jù)抗原、抗體可進(jìn)行特異性結(jié)合的原理，應(yīng)用已知的抗原檢測未知的抗體或應(yīng)用已知的抗體檢測未知抗原。該技術(shù)特異性高，簡便安全，能快速準(zhǔn)確地診斷感染性疾病，有利于疾病的早期診斷。

3.1 血清中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)是在測定病毒感染力的基礎(chǔ)上，以比較病毒受免疫血清中和后的殘存感染力為依據(jù)，用于判定免疫血清中和病毒的能力的一種方法，該方法具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，檢測靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。有學(xué)者以PK15（豬腎細(xì)胞）為指示細(xì)胞，采用適應(yīng)Vero細(xì)胞的PEDV將醛化鞣酸化紅細(xì)胞致敏，建立了PEDV微量中和試驗(yàn)，該方法特異性好，操作簡便，可用于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查[5]。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是一種成熟的實(shí)驗(yàn)室血清學(xué)檢測方法，包含間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、競爭ELISA等，被定為國際貿(mào)易標(biāo)準(zhǔn)診斷方法之一[8]。ELISA 具備易于操作、價(jià)格低、靈敏度高、檢測迅速等優(yōu)勢，ELISA既可以從病豬的糞便中檢測出PEDV抗原，又可以從病豬的血清中檢測出PEDV抗體[9]。ELISA法出現(xiàn)之前，許多國外科學(xué)家應(yīng)用培養(yǎng)的病毒檢測PEDV抗體。鄧祖麗穎[10]等利用豬流行性腹瀉病毒抗原重組蛋白包被96孔板建立了間接ELISA方法用于檢測PEDV S蛋白抗體，并利用該方法對河南省不同地區(qū)豬場的母豬和育肥豬進(jìn)行檢測，陽性對照血清呈亮橙色，陰性對照血清孔無色或基本無色。結(jié)果表明來自河南不同地區(qū)23個(gè)豬場的279份血清中母豬陽性率為97.42%，育肥豬陽性率為71.74%。因?yàn)樨i流行性腹瀉病毒難以適應(yīng)細(xì)胞培育，全病毒抗原制備的潛在危險(xiǎn)，導(dǎo)致ELISA診斷技術(shù)僅限于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

4 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

分子生物學(xué)檢測技術(shù)是根據(jù)基因中的某一序列，檢測出基因中所包含的抗體。可以彌補(bǔ)免疫技術(shù)的缺陷，縮短診斷時(shí)間，且該技術(shù)應(yīng)用廣泛，可用于各種病原微生物的檢測。

4.1 熒光定量PCR技術(shù)

熒光定量PCR技術(shù)具備重復(fù)性好、靈敏性高等優(yōu)勢，檢測技術(shù)要優(yōu)于其他的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，被世界動(dòng)植物衛(wèi)生組織（OIE）引薦用于動(dòng)物疾病的檢測[11]。該技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，應(yīng)用熒光信號累積實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后經(jīng)過詳細(xì)的數(shù)學(xué)原理對未知模板的定量剖析[12]。 劉鄧等[13]根據(jù) PEDV N 基因序列設(shè)計(jì)一對特異性引物和探針，建立了TaqMan熒光定量PCR方法，并檢測了80份臨床樣本的PEDV病毒含量，陽性率為95%，而反轉(zhuǎn)錄PCR檢測陽性率為85%，表明該措施靈敏性顯著高于一般PCR，可以利用熒光定量技術(shù)對PEDV病毒進(jìn)行檢測。

4.2 反轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse Transcriptional PCR，RT-PCR）

RT-PCR方法簡便、快速、靈敏、特異，是實(shí)驗(yàn)室中常用的分子生物學(xué)診斷方法之一。吳學(xué)敏等[14]建立了檢測PEDV M基因的RT-PCR方法，該方法具備較好的特異性和靈敏性，能精準(zhǔn)地檢測到PEDV RNA 100 pg，可用于臨床診斷豬流行性腹瀉病毒。郭容利[15]等采用RT-PCR方法檢測江蘇、安徽、河北、山東等地的146頭仔豬腹瀉樣品，82份樣品為PEDV陽性。

4.3 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是一種特殊形式的PCR，分子生物學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域研究應(yīng)用到多重PCR，例如病原體鑒定、遺傳性疾病診斷等[12]。臨床不能確定病豬被何種病毒感染時(shí)，通常采用多重PCR方法，一次反應(yīng)就可以鑒別樣品中的TGEV和PEDV，甚至鑒別更多病原種類，結(jié)果較準(zhǔn)確，從而達(dá)到診斷和治療的作用。多重PCR和一般PCR比較，更加快速、方便，可短時(shí)間內(nèi)提供結(jié)果。

4.4 膠體金免疫技術(shù)

膠體金免疫技術(shù)由于其靈敏性和特異性高的優(yōu)勢，無需特殊儀器，直接可以判斷結(jié)果，適用于基層獸醫(yī)部門。張利勃[16]等對金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）的膠體金進(jìn)行標(biāo)記作為指示介質(zhì)，用重組表達(dá)的PEDV M蛋白抗原和抗金黃色葡萄球菌蛋白A（SPA）的基因抗體作為檢測線和指控線，開發(fā)出用于檢測PEDV血清抗體的膠體金免疫層析試紙條，進(jìn)一步試驗(yàn)證明該試紙的靈敏度和ELISA幾乎相同，符合率達(dá)96%。該試紙還具有靈敏度高、簡潔快速等優(yōu)點(diǎn)，為基層檢測抗體提供便捷的措施。

5 其他檢測技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是利用體外核酸反應(yīng)，在恒定的溫度下，添加酶和特異性引物，得到迅速的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法設(shè)備簡單、易于掌握、有效節(jié)省時(shí)間[17]。 鄭新添[18]等將 PEDV 的 NP 基因，進(jìn)行序列分析，成功設(shè)計(jì)了LAMP引物，優(yōu)化反應(yīng)體系，在65℃下擴(kuò)增60 min，借助核酸染料染色后只需肉眼便可觀察、判定結(jié)果。王偉[19]等根據(jù)PEDV的M基因建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高的LAMP檢測方法。羅亞坤[20]等基于PEDV的N基因設(shè)計(jì)6對引物，對建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化，成功建立了PEDV LAMP檢測方法。

6 預(yù)防途徑

豬場的環(huán)境衛(wèi)生對預(yù)防病原感染具有重要的作用，因此保持豬場的環(huán)境衛(wèi)生、保持地面整潔，定期清理排泄物、立即隔離患病豬[21]等措施對有效控制該病的傳播具有重要意義。定期對豬場內(nèi)部的通道、圈舍、相關(guān)用具進(jìn)行清理和消毒，消毒時(shí)間應(yīng)該安排在清理糞便之后，消毒次數(shù)為每天2次左右。同時(shí)還要經(jīng)常對豬舍內(nèi)的鼠、蒼蠅、蟲類進(jìn)行消滅處理。對新引進(jìn)的豬進(jìn)行隔離觀察，一旦疫情發(fā)生，及時(shí)焚燒和掩埋死亡的豬，最大限度將疫情控制在最小范圍。

7 結(jié)語

腹瀉類疾病是影響豬只健康的一類重要疾病，尤其是危害仔豬健康，而引起仔豬腹瀉的病因復(fù)雜，包括飼養(yǎng)管理、斷奶應(yīng)激、病原感染等，其中PEDV是引起仔豬腹瀉的病毒性疾病最重要的病原之一。該病傳播迅速，在我國豬場中廣泛存在，一旦發(fā)病較難控制，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，增加養(yǎng)殖成本，同時(shí)若通過投放大量的藥物進(jìn)行預(yù)防或治療，由于藥物殘留問題給食品安全帶來隱患[22]。豬群發(fā)病時(shí)可以采取藥物治療和饑餓療法相結(jié)合的方法進(jìn)行治療，對于一些嚴(yán)重的仔豬可以考慮靜脈注射和腹腔注射給藥[23]。隨著生物科技的不斷進(jìn)步，對于該類疾病的診斷技術(shù)日趨完善，只有盡早對該病進(jìn)行確診才能及時(shí)采取相應(yīng)的治療手段，最大限度減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)損失。