蓽茇藥材中蓽茇酰胺高效液相色譜研究※

賈貴清 吳小愚 王玉玨 趙高平*

（1 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胃腸外科，成都 610072；2 四川科倫藥業(yè)股份有限公司，成都 610072）

蓽茇（Piper Longun L.），系胡椒科（Piperaceae）植物，其常用入藥部位是干燥近成熟或成熟的果穗，味辛大溫，無毒，歸胃、大腸經(jīng)，具有溫中散寒、下氣止痛之功效，中醫(yī)多用于治療泄瀉、偏頭痛及牙痛等，是中、蒙、藏、維醫(yī)的習(xí)慣用藥，收載于《中國藥典》 (2015年版一部)[1]及《中華人民共和國藥典衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊》[2]?，F(xiàn)代研究表明蓽茇具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、抗炎、止痛及免疫調(diào)節(jié)、降血脂、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、抗胃潰瘍、耐缺氧、抗急性心肌缺血、抗心律失常等多種藥理學(xué)活性[3-4]，其中蓽茇酰胺是其主要藥理成分，對腫瘤細(xì)胞具有顯著細(xì)胞毒作用，還具有抗血小板、抗動脈粥樣硬化、抗狼瘡性腎炎、抗帕金森病等作用，表現(xiàn)出抗血小板凝集、抗炎鎮(zhèn)痛、抗真菌等諸多藥理活性[5]，越來越受到人們的關(guān)注。

由于中藥不良反應(yīng)事件不斷被報(bào)道，所以中藥安全性已為國內(nèi)外所關(guān)注，對于中藥的質(zhì)量控制要求更為嚴(yán)格[6]。2015版《中國藥典》收載胡椒堿作為蓽茇果實(shí)藥材的指標(biāo)性成分，但蓽茇中的成分較為復(fù)雜，為了更準(zhǔn)確地控制蓽茇藥材的含量，本文旨在以蓽菝酰胺為指標(biāo)性成分，以成熟穩(wěn)定的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC） 為手段，建立分析方法，用于對不同產(chǎn)地蓽茇藥材及其不同藥用部位進(jìn)行對比分析，為蓽茇藥材的道地性和質(zhì)量評價(jià)提供更全面可靠的依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀系列，包括：檢測器 (G1365D DAD)，四元梯度泵 (G1311A Quat Pump)，在線真空脫氣機(jī) (G1332A)，自動進(jìn)樣器 (G1329A ALS)，柱溫箱 (G1316A Colcom)， 工作站 (Agilent Chemstation system) (Agilent Technologies， 美國)；超聲波清洗器，甲醇（HPLC級）、超純水、蓽茇酰胺對照品（上海源葉生物科技有限公司），其余試劑均為分析純。蓽茇藥材分別來自于廣西、廣東、海南、福建、江西，經(jīng)四川大學(xué)華西藥學(xué)院何俊博士鑒定為胡椒科植物蓽茇Piper longum L.

2 研究方法

2.1 色譜條件 Agilent 1100， 色譜柱為迪馬Diamond C18， 5μm 250×4.6mm， 流動相甲醇-水 （35∶65）， 流速1 mL·min-1，檢測波長254 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蓽茇酰胺對照品10.35 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為胡椒堿儲備液，依次精密吸取1、2、4、6、8、9 mL分別容于10 mL容量瓶中，加甲醇定容后，即得系列蓽茇酰胺對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的蓽茇藥材粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇30 mL，浸泡60 min后，超聲提取40 min（150 w/60 KHz），過濾，重復(fù)2次，合并濾液，減壓蒸餾揮干溶劑，殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ葜?5 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL按“2.1”項(xiàng)下中的色譜條件進(jìn)樣測定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo) (X)，峰面積為縱坐標(biāo) (Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，記錄峰面積值。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一濃度的蓽茇酰胺對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，在2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的藥材粉末，按照“2.3.2”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液6份，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測定，計(jì)算峰面積的RSD值。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一濃度的蓽茇供試品溶液分別在0、1、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測試，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，了解24 h內(nèi)試劑穩(wěn)定性。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 分別精密稱取已知蓽茇酰胺含量的蓽茇藥材粉末6份，每份約0.5g。精密稱取蓽茇酰胺對照品20.08 mg，甲醇溶解定容至50 mL，分別精密量取5 mL加入上述粉末中，按照“3”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。

2.4 蓽茇藥材的含量測定 取不同產(chǎn)地及不同藥用部位的蓽茇藥材粉末按照“3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，每批6個(gè)平行樣品，精密吸取20 μL按上述色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算含量和RSD值。

3 結(jié)果

線性關(guān)系考察進(jìn)樣測定得到回歸方程為A=13587685.5C-48597.12（r=0.9999）， 在 0.0411～0.3835 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，色譜圖見圖1。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示RSD=1.89%（n=6），提示精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明該法重復(fù)性良好，RSD=2.66%。該方法在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，其RSD=2.73%（n=8）。而試驗(yàn)加樣回收率在98.40%～102.38%，表明試驗(yàn)方法具有較好的準(zhǔn)確度，見表1。不同產(chǎn)地的蓽茇藥材果實(shí)及莖中蓽茇酰胺的含量有一定的差異，其中以廣西田林縣蓽茇果實(shí)中蓽茇酰胺含量最高，見表2。浦北縣蓽茇莖中蓽茇酰胺含量最高，見表3。

圖1 對照品（A）和供試品（B）液相色譜圖

表1 加樣回收試驗(yàn)

表2 不同產(chǎn)地的蓽茇果實(shí)中的蓽茇酰胺含量 （n=6）

表3 不同產(chǎn)地的蓽茇莖的蓽茇酰胺含量 （n=6）

圖2 蓽茇酰胺

4 討論

蓽茇酰胺又稱蓽茇明堿，其化學(xué)名為3、4、5-三甲氧基肉桂酰環(huán)己酰胺，分子式為C17H19NO5，結(jié)構(gòu)如圖2。屬于生物堿酰胺類化合物，最初主要從印度南部以東南亞的胡椒科植物蓽茇的根中分離而得，在長柄胡椒 (P.sylvaticumRoxb.)和瘤突胡椒（P.tuberculatum Jacq.）的根中可以分離得到。近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)蓽茇藥材中主要的藥理作用為蓽茇酰胺，后者具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗抑郁，甚至抗惡性腫瘤等多種藥理活性作用，且對正常的細(xì)胞、組織、器官無明顯的毒副作用[4-5，7-8]。2011年Raj等[9]在《Nature》上發(fā)表了蓽茇酰胺體外試驗(yàn)具有選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，而對正常組織細(xì)胞無明顯影響，并且詳細(xì)得出了植物天然成分蓽茇酰胺不依賴p53等抑癌基因的狀態(tài)，能明顯降低乳腺癌細(xì)胞株、骨肉瘤癌細(xì)胞、慢性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤B細(xì)胞等14種不同起源的腫瘤細(xì)胞株的活力，其平均半數(shù)致死量（IC50）為7 μmol/L，而即使將蓽茇酰胺濃度增加到15 μmol/L也不影響主動脈內(nèi)皮細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞等6種非腫瘤細(xì)胞株的活力。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)低摩爾濃度的蓽茇酰胺也能抑制EBV非轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染B淋巴腫瘤細(xì)胞的生存平衡，且不傷害正常外周血B淋巴細(xì)胞沒有毒性。蓽茇酰胺還可以降低核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活性，下調(diào)c-myc的表達(dá)，通過影響NF-κB/MYC關(guān)鍵靶基因 (如下調(diào)MYB、E2F1和上調(diào)GADD45B)的表達(dá)水平，進(jìn)而殺傷淋巴腫瘤細(xì)胞。此研究也為B細(xì)胞惡性腫瘤的治療策略以及其他類型血液癌癥的預(yù)防和治療提供新方法[10]。因此，Raj等人的研究再次掀起了對中國傳統(tǒng)藥材蓽茇抗腫瘤的研究熱潮，而目前對蓽茇酰胺的提純與凈化等工序尚無完整、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

中藥材成分復(fù)雜，一般以其具有生理活性的主要化學(xué)成分作為質(zhì)量評價(jià)和質(zhì)量控制指標(biāo)，目前在中藥的質(zhì)量控制方面，傾向于多成分、多指標(biāo)控制。而以往對于蓽茇的質(zhì)量控制只采用胡椒堿為單一指標(biāo)成分。本實(shí)驗(yàn)突破了以往僅采用胡椒堿為指標(biāo)成分的指標(biāo)質(zhì)量控制方法，還研究測定蓽茇中蓽茇明酰胺的含量，為蓽茇藥材多指標(biāo)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)，也為含此類酰胺類生物堿類成分的其他藥材定量分析提供了參考。常用的測定方法有紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用法、氣相色譜法、核磁共振波普法等[11]，其中HPLC分為分析型和制備型高效液相色譜法兩種，適用于極性、非極性、離子型及高分子化合物的分離與分析，是以經(jīng)典的液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜的理論和試驗(yàn)方法，高壓輸送流動相，采用高效固定相及在線檢測等手段發(fā)展而來，具有分離效能高、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。本研究采用分析型高效液相色譜法，通過對不同檢測波長（200～400 nm）掃描檢測和圖譜分析比較，在250 nm時(shí)能檢測到較多的蓽茇酰胺成分峰信息，故選擇250 nm作為檢測波長。查閱有關(guān)文獻(xiàn)[1]，對甲醇-水，甲醇-0.2%甲酸，乙腈-水，乙腈-0.2%甲酸不同比例的流動相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫試驗(yàn)摸索和比較分析，結(jié)果表明，甲醇-水（35∶65） 進(jìn)行梯度洗脫得到的圖譜色譜峰分離度好，基線平穩(wěn)，保留時(shí)間適中，最終確定以甲醇-水一定比例洗脫作為流動相，以254 nm為檢測波長的基本色譜條件，這與徐麗芳[12]應(yīng)用HPLC測定山香圓葉藥材的方法相似，但采用乙腈-0.5%磷酸水溶液、波長在200～400 nm，未進(jìn)行波長分析比較。制備型高效液相色譜法的理論與設(shè)備基礎(chǔ)目前尚未完善，但是是以分析型為基礎(chǔ)，隨著中藥學(xué)科的不斷發(fā)展，中藥含量測定的研究也會更加的全面，制備型的高效液相色譜法會表現(xiàn)出更為廣闊的前景。

蓽茇生長在海拔200～1000 m的低谷、河谷和盆地邊緣的濕熱地區(qū)，我國國內(nèi)主產(chǎn)于云南、廣東，北方如河北等地也有生長，國外主產(chǎn)于印度尼西亞、菲律賓、越南等國，不同產(chǎn)地及不同藥用部位的中藥材存在一定的成分差異[13-14]，本研究證實(shí)我國廣西田林縣蓽茇果實(shí)中蓽茇酰胺含量最高，而安徽亳州市的蓽茇中蓽茇酰胺含量最低，中藥材中各成分含量的高低可能與藥材生長的海拔、緯度、土壤以及日照強(qiáng)度和時(shí)間等因素有關(guān)。此外，同一株中藥材植物不同藥用部分中成分含量也不盡相同，蓽茇酰胺在果實(shí)中含量最高，莖、葉中含量較少，我們的研究也證實(shí)了果實(shí)中蓽茇酰胺的含量較莖中高。

綜上所述，本研究證實(shí)了不同產(chǎn)地及不同藥用部位蓽茇中蓽茇酰胺的含量有所差異，同時(shí)建立了一種HPLC測定蓽茇藥材中蓽茇酰胺含量的方法，結(jié)果顯示該方法精密度高、穩(wěn)定性及重復(fù)性和加樣回收率等較為理想，提供了一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的測定蓽茇中蓽茇酰胺含量的方法，值得推廣。