常壓滅菌工藝對食用菌培養(yǎng)料質(zhì)量性狀 及子實體產(chǎn)量的影響

陳 青，陳 天，錢瓊秋，陳再鳴*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 杭州 310058；2.上海浩澤凈水科技發(fā)展有限公司，上海 201206； 3.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

隨著食用菌 “機器換人”產(chǎn)業(yè)趨勢的興起，菌袋集約化生產(chǎn)得到快速發(fā)展。目前，浙江省香菇、木耳等菌袋集約化生產(chǎn)量已超1億袋，占全省食用菌總生產(chǎn)量的1/4，成為食用菌生產(chǎn)方式轉(zhuǎn)型的支點之一[1]。但這種新興產(chǎn)業(yè)模式尚存在諸多急需解決的關(guān)鍵技術(shù)問題，目前的研究多集中在菌種、培養(yǎng)料配方和栽培條件控制等方面，如張介馳等[2]研究了發(fā)菌溫度對黑木耳菌絲和子實體生長的影響，認為適當(dāng)?shù)蜏匕l(fā)菌有利于黑木耳產(chǎn)量和品質(zhì)的提高；馬瑞霞[3]研究了不同配方培養(yǎng)料對白靈菇生長發(fā)育和產(chǎn)量的影響。根據(jù)食用菌生物學(xué)特性，菌絲體營養(yǎng)和生殖生長高度依賴于其培養(yǎng)料的理化和生物性狀，陳青等[4]研究認為，秀珍菇培養(yǎng)料的理化性狀與其菌絲營養(yǎng)和生殖生長相關(guān)性強，對培養(yǎng)料全面質(zhì)量性狀與子實體形成的相關(guān)性方面進行系統(tǒng)研究，有助于解決菌袋生產(chǎn)中存在的標準缺陷等瓶頸制約難題，尤其是香菇、木耳等菌袋的集約化生產(chǎn)，常規(guī)工藝普遍采用聚乙烯長袋裝袋和常壓滅菌法，雖然此法投資較少、設(shè)施簡單，但耗時耗能，加上每次滅菌數(shù)量大、過程控制經(jīng)驗化，往往造成因滅菌環(huán)節(jié)失控引發(fā)的微生物厭氧發(fā)酵，導(dǎo)致培養(yǎng)料營養(yǎng)分解、pH下降、微生物次生代謝有害物質(zhì)積累，致使料袋劣變，對接種后菌絲營養(yǎng)和子實體生長帶來負面影響，造成不同程度的生產(chǎn)安全隱患。針對上述問題，作者進行了培養(yǎng)料常壓滅菌工藝對香菇、木耳菌袋質(zhì)量性狀變化與菌絲生長和產(chǎn)量的相關(guān)性研究，旨在為困擾食用菌菌袋集約化生產(chǎn)中高效滅菌難題提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 品種

所用黑木耳品種為916，香菇品種為L808。均來自浙江大學(xué)食用菌研究中心。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

黑木耳試驗配方為闊葉樹木屑86.6%，麩皮10.7%，碳酸鈣2%，石灰0.7%，含水量(53±1)%。

香菇試驗配方為闊葉樹木屑78%，麩皮20%，石膏2%，含水量(62±1)%。

1.2 方法

1.2.1 黑木耳試驗

培養(yǎng)料配制。按配方將各配料加水后用攪拌機進行充分混合，用規(guī)格為15 cm×55 cm的聚乙烯塑料袋裝料，濕重1.7～1.8 kg·袋-1。裝袋全程在拌料后2 h內(nèi)完成。

料袋滅菌處理設(shè)計。采用木耳料袋集約化制作時的主流常壓滅菌工藝。以滅菌時料袋的不同堆疊方式設(shè)計2個處理,試驗組(T1)處理為周轉(zhuǎn)架堆疊方式，對照組T2(CK1)處理為料袋直接墻式堆疊。2組處理的滅菌料袋數(shù)量均為單柜1萬袋。預(yù)備試驗先測定2組處理從滅菌起始至料袋升溫到100 ℃(料溫中心溫度)所需的時間，結(jié)果T1為2 h，T2為12 h。同時預(yù)備試驗還設(shè)計了料溫升到100 ℃為滅菌計時點，每6 h檢測一次料袋滅菌后的菌落總數(shù)，以此作為正式試驗時的滅菌標準參數(shù)。最后確定的滅菌程序為：T1處理組2 h升溫至100 ℃，100 ℃保溫12 h，冷卻至80 ℃結(jié)束，T2處理組12 h升溫至100 ℃，100 ℃保持72 h，冷卻至80 ℃結(jié)束。以上每組處理設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)數(shù)為90袋。

接種、培養(yǎng)及出耳管理。各組料袋同時接種固體栽培種(常規(guī)三級制種法制種)，20～25 ℃培養(yǎng)，觀察菌絲萌發(fā)，每7 d測量菌絲營養(yǎng)生長情況，直到菌絲滿袋后結(jié)束。菌袋后熟完成，進行刺孔、催耳和排場、露地栽培，管理同常規(guī)。記錄采收日期和各潮產(chǎn)量。

1.2.2 香菇試驗

培養(yǎng)料配料、裝袋。按配方將各配料加水后用攪拌機進行充分混合，用規(guī)格為15 cm×55 cm的聚乙烯塑料袋裝料，濕重1.9～2.0 kg·袋-1。裝袋全程在拌料后2 h內(nèi)完成。

料袋滅菌處理設(shè)計。采用香菇料袋集約化制作時的主流常壓滅菌工藝。以滅菌時料袋的不同堆疊方式設(shè)計2個處理,試驗組(T3)處理為周轉(zhuǎn)架堆疊方式，對照組T4(CK2)處理為料袋直接墻式堆疊，2組處理的滅菌料袋數(shù)量均為單柜1萬袋。預(yù)備試驗先測定2組處理從滅菌起始至料袋升溫到100 ℃(料溫中心溫度)所需的時間，結(jié)果T3為4 h，T4為11 h。同時預(yù)備試驗還設(shè)計了料溫升到100 ℃為滅菌計時點，每6 h檢測一次料袋滅菌后的菌落總數(shù)，以此作為正式試驗時的滅菌標準參數(shù)。最后確定的滅菌程序為：T3處理組4 h升溫至100 ℃，在100 ℃保溫24 h，冷卻至80 ℃結(jié)束，T4處理組11 h升溫至100 ℃，在100 ℃保持60 h，冷卻至80 ℃結(jié)束。以上每組處理設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)數(shù)為90袋。

接種、培養(yǎng)及出菇管理。各組料袋同時接種固體栽培種(常規(guī)三級制種法制種)，20～24 ℃培養(yǎng)，觀察菌絲萌發(fā)，每7 d測量菌絲營養(yǎng)生長情況，直到菌絲滿袋后結(jié)束。菌袋后熟、轉(zhuǎn)色，統(tǒng)一脫袋出菇，管理同常規(guī)，記錄采收日期和分期產(chǎn)量。

1.2.3 理化性狀檢測

各組滅菌后的料袋隨機抽樣3袋，作為測定各項理化指標的樣品。樣品經(jīng)50～60 ℃風(fēng)干10 h，粉碎后作為待檢測樣品。以四分法取混合樣品，一半作物理分析，另一半作化學(xué)分析。

參照文獻[5]方法，測定容重、通氣孔隙度、吸水能力(含水量)和化學(xué)指標EC、pH值、粗蛋白、粗纖維、可溶性碳水化合物等理化指標。其中粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法(丹麥FOSS-8500全自動凱氏定氮儀)，纖維素測定用丹麥FOSS-FT350儀，可溶性碳水化合物采用差減法，EC值用BANTE520型EC計、pH 值用PHS-3C型pH計測定。

1.2.4 生物性狀檢測

菌絲萌發(fā)率檢測。采用液體菌種萌發(fā)法。液體菌種培養(yǎng)所用種源同1.1.1節(jié)的固體栽培種所用種源。培養(yǎng)基為PDA去除瓊脂后的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為24 ℃、120 r·min-1、96 h。接種前，采用TTC法進行菌種活力檢驗。檢測時，取1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)滅菌后的料袋，無菌操作接入用三角瓶搖床發(fā)酵制備的液體菌種，每袋接種量為10 mL。(23±2) ℃培養(yǎng)，觀察菌絲營養(yǎng)生長情況。重復(fù)3次，每次5袋。

培養(yǎng)料菌落總數(shù)和細菌殘留檢測。參照文獻[6]方法，取1.2.1節(jié)和1.2.2節(jié)滅菌后的培養(yǎng)料樣品各10 g，制成10～106稀釋液，然后取104～106倍的稀釋液0.1 mL，涂布平板，32 ℃培養(yǎng)48 h。菌落總數(shù)按細菌和真菌合計，細菌采用結(jié)晶紫單染法進行菌體形態(tài)觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)處理采用DPS統(tǒng)計分析軟件，用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 對培養(yǎng)料理化性狀的影響

不同常壓滅菌工藝對黑木耳和香菇料袋培養(yǎng)料理化性質(zhì)影響見表1。物理性狀方面， T1、T3培養(yǎng)料的容重和含水量均比相應(yīng)的對照組T2、T4略有增大，而通氣孔隙度均呈現(xiàn)減小現(xiàn)象。化學(xué)性狀方面，試驗組T1、T3的EC值分別為5.5和5.1 mS·cm-1，與其相應(yīng)的對照組也基本相同；pH指標在黑木耳培養(yǎng)料T1組為6.0，T2組為4.5，香菇培養(yǎng)料T3組為5.8，T4組只有4.4，這二種培養(yǎng)料的試驗組與對照組均呈現(xiàn)出顯著性差異，從感官上有明顯的酸臭味。從營養(yǎng)成分的變化看，T1、T3的粗蛋白、碳水化合物含量比與其相應(yīng)的對照組T2、T4高，而粗纖維含量二者差異較小。

表1 不同滅菌處理培養(yǎng)料理化指標

常規(guī)配制食用菌培養(yǎng)料時，只對碳含量、氮含量、碳氮比、含水量、pH等指標有比較明確的要求，而忽視對培養(yǎng)料的物理、化學(xué)和生物等綜合性狀的檢測。根據(jù)真菌菌絲生物學(xué)特性，培養(yǎng)料綜合質(zhì)量性狀會與菌絲營養(yǎng)生長和生殖生長密切相關(guān)，三者之間不可偏頗。容重、孔隙度反映了培養(yǎng)料的持水率和透氣性，而這一特性又與菌絲營養(yǎng)生長和生殖生長高度相關(guān)。EC在植物基質(zhì)檢測中是常用指標之一，一般適宜的植物基質(zhì)電導(dǎo)率為≤3.5 mS·cm-1，食用菌培養(yǎng)料的EC值往往高于植物基質(zhì)，這是由于食用菌菌絲代謝需要較高的營養(yǎng)成分，但過高的EC也會抑制菌絲的代謝[7]。結(jié)果也表明，不良的滅菌工藝會導(dǎo)致培養(yǎng)料理化性狀的劣變，從而抑制菌絲生長。

2.2 對培養(yǎng)料生物指標的影響

對黑木耳和香菇二種料袋的滅菌預(yù)備試驗獲得的培養(yǎng)料進行了菌落總數(shù)檢測，結(jié)果見表2。從結(jié)果可見，T1、T3試驗組培養(yǎng)料滅菌徹底所需的時間為12和24 h，比對照T2、T4分別縮短了54和36 h。這種實驗料袋之間菌落總數(shù)變化的差異，主要是實驗組與對照組料袋在滅菌升溫階段所需的時間長短不同造成。實驗組(T1、T3)在料袋堆疊方式上用周轉(zhuǎn)架代替對照組(T2、T4)的墻式堆疊法，使料袋間空隙增加，提高了蒸汽的穿透性，縮短了料袋滅菌升溫時間，從而避免了料袋在35～65 ℃的中高溫區(qū)間芽孢桿菌的大量繁殖，因此料袋中菌落總數(shù)少，滅菌所需的時間也相應(yīng)縮短。

表2 常壓滅菌不同時間培養(yǎng)料的菌落總數(shù) 個·皿-1

注：料袋溫度達到100 ℃開始計時。

料袋菌絲萌發(fā)率檢測是檢驗培養(yǎng)料質(zhì)量的重要生物指標。萌發(fā)試驗所用的液體菌種在接種前均采用TTC法進行活力測試，菌絲活力良好。表3結(jié)果顯示，T1、T3試驗組料袋接種后菌絲萌發(fā)率為100%，而T2、T4組的料袋菌絲萌發(fā)率分別只有10.7%和15.2%。菌落總數(shù)檢測表明，T1、T3試驗組料袋無細菌感染，而T2、T4組的料袋則殘留了大量的未經(jīng)殺滅的芽孢桿菌，鏡檢結(jié)果顯示，芽孢桿菌種類至少在4種以上。據(jù)分析，芽孢桿菌的厭氧發(fā)酵會導(dǎo)致培養(yǎng)料營養(yǎng)喪失、生物毒素積累和pH的下降，使培養(yǎng)料產(chǎn)生劣變，抑制菌絲營養(yǎng)生長，嚴重影響子實體的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，料袋生物性狀是培養(yǎng)料質(zhì)量控制的重要指標之一。

表3 不同滅菌處理培養(yǎng)料的生物指標

2.3 對菌絲營養(yǎng)生長的影響

2.3.1 黑木耳

黑木耳料袋接種后，經(jīng)20～25 ℃培養(yǎng)，測量和比較菌絲營養(yǎng)生長情況。從T1和T2組菌絲營養(yǎng)生長速度看，T2組料袋接種后菌種萌發(fā)時間為48 h，菌絲滿袋時間為49 d，平均生長速度為0.96 mm·d-1，而T1組料袋接種后菌種萌發(fā)時間為24 h，菌絲滿袋時間為43 d，平均生長速度為1.04 mm·d-1，比對照提前6 d發(fā)滿全袋，同時，T1菌絲比T2濃白、粗壯。從菌袋成品率統(tǒng)計，T1組菌袋接種成品率99.5%，T2的菌袋成品率只有89.0%，二者差異明顯。

2.3.2 香菇

香菇料袋接種后，經(jīng)20～24 ℃培養(yǎng)，測量和比較菌絲營養(yǎng)生長情況。從菌絲營養(yǎng)生長速度看，T4組料袋接種后菌種萌發(fā)時間為48 h，菌絲滿袋時間為55 d，平均生長速度為0.85 mm·d-1，而T3組料袋接種后菌種萌發(fā)時間為24 h，菌絲滿袋時間為49 d，平均生長速度為0.96 mm·d-1，比對照提前6 d發(fā)滿全袋。從菌絲形態(tài)觀察，T3菌絲比T4濃白、粗壯。從菌袋成品率統(tǒng)計，T3組菌袋接種成品率99.7%，T4的菌袋成品率只有92.0%，二者差異明顯。

本實驗結(jié)果說明，黑木耳、香菇的培養(yǎng)料隨著滅菌時間的延長，料袋的理化、生物性狀劣變，導(dǎo)致菌種萌發(fā)減慢、抗性下降，菌絲生長速度也減慢。分析認為，培養(yǎng)料良好的理化、生物性狀與菌絲營養(yǎng)生長呈高度正相關(guān)性，尤其是pH、萌發(fā)率等2個指標，能正確反映培養(yǎng)料的特性與菌絲營養(yǎng)生長的關(guān)系，因此，可作為培養(yǎng)料制作的重要技術(shù)參考指標。

2.4 對子實體產(chǎn)量的影響

2.4.1 黑木耳

菌袋滿袋后，進行刺孔、催耳和排場，露地栽培出耳，結(jié)果見表4。實驗菌袋在第49天刺孔，第58天排場出田，至第212天出耳結(jié)束，共采收5潮木耳。其中第1潮木耳采收時間，T1為104 d，T2為115 d，T1比T2提早11 d。從各潮次產(chǎn)量比較分析，統(tǒng)計冬耳和春耳二個階段的產(chǎn)量情況，T1冬耳共采收3潮，產(chǎn)量49.5 g(干耳)，比T2的2潮、28.0 g，增產(chǎn)76.8%。從總產(chǎn)統(tǒng)計，T1比T2增加28.9%。由于木耳栽培中，冬耳品質(zhì)明顯優(yōu)于春耳，加上市場消費因素，一般冬耳的價格也明顯高于春耳，所以，提早出耳、增加冬耳比例，對提升黑木耳栽培的經(jīng)濟效益關(guān)系重大。從本試驗看，滅菌工藝會對黑木耳出耳周期和產(chǎn)量產(chǎn)生較大的影響，因此，集約化菌袋生產(chǎn)中必須提高對這一工藝環(huán)節(jié)的認知。

表4 不同滅菌工藝對黑木耳產(chǎn)量的影響

2.4.2 香菇

菌袋滿袋后，進行后熟、轉(zhuǎn)色、脫袋和栽培出菇，結(jié)果見表5。試驗菌袋在第120天脫袋出菇，至第205天出菇結(jié)束，共統(tǒng)計3潮菇。從采收時間分析，T3和T4的3潮菇均在同一時間采收，說明二者菌袋菌絲的成熟度較一致，無明顯差異；從總產(chǎn)量比較，T3為720 g(鮮菇)，較T4的670 g增產(chǎn)7.5%，無統(tǒng)計學(xué)上的差異；再進一步從分期產(chǎn)量看，T3組的前2潮菇總產(chǎn)量為380 g，而T4組為320 g，T3比T4增產(chǎn)18.8%，說明T3組的香菇產(chǎn)量在早中期較高，而T4的菌袋后期出菇相對較多。由此分析，新工藝滅菌由于提高了料袋的質(zhì)量，促進了菌絲的營養(yǎng)生長，使菌絲在出菇前較多地積累了養(yǎng)分，提高了前期的產(chǎn)量。這與對黑木耳的影響趨勢一致。

表5 不同滅菌工藝對香菇產(chǎn)量的影響

3 小結(jié)與討論

食用菌培養(yǎng)料的作用除了提供菌絲生長所需營養(yǎng)外，還作為菌絲的固定物，它影響著菌絲生長過程的傳質(zhì)、傳熱和代謝功能，繼而與栽培產(chǎn)量和質(zhì)量有著高度的相關(guān)性[8]。所以，培養(yǎng)料的質(zhì)量性狀(包括物理、化學(xué)和生物性狀)的控制尤為重要。研究分析，質(zhì)量性狀除與配方使用的各種原料有關(guān)外，配制過程也是一個重要環(huán)節(jié)，而滅菌工藝是配制過程中質(zhì)量關(guān)鍵控制點，它會對培養(yǎng)料的各種質(zhì)量性狀指標產(chǎn)生重要的影響。

培養(yǎng)料的物理性狀中，料的顆粒大小、容重、孔隙度等影響著菌絲的生物量積累、氧氣的供給和二氧化碳的移出率；同時，含水量對菌絲營養(yǎng)和生殖生長影響巨大，良好的培養(yǎng)料要求沒有游離水且水活度在0.6～0.7，這樣既適合食用菌菌絲的生長，又可以排除其他雜菌的污染[9]?；瘜W(xué)性狀中，除了碳源、氮源等主要營養(yǎng)成分，EC反映了培養(yǎng)料的可溶性鹽(主要由有機酸鹽和無機鹽等組成)的含量，也是對菌絲產(chǎn)生抑制作用的主要因素之一。根據(jù)資料，植物基質(zhì)的適宜EC范圍是≤3.5 mS·cm-1，食用菌培養(yǎng)料適宜的EC范圍還未見報道，本研究結(jié)果顯示，正常常壓滅菌后培養(yǎng)料的EC在5.4 mS·cm-1左右，料袋厭氧發(fā)酵會使其EC值增大，從而導(dǎo)致菌絲營養(yǎng)生長受到抑制[10]。pH也是影響菌絲生長的重要指標之一。大部分食用菌菌絲適宜的pH在6.5～7.0[11]，但滅菌會降低培養(yǎng)料的pH，正常情況下下降范圍在1.5～2.0，所以在培養(yǎng)料配制時，往往需要添加石膏、碳酸鈣和石灰等緩沖物質(zhì)以提高培養(yǎng)料的起始pH至8.0～8.5，這樣滅菌后的培養(yǎng)料pH可以保持在合適的范圍內(nèi)，滿足菌絲生長發(fā)育的需要。本實驗的香菇、木耳菇種，其料袋集約化生產(chǎn)中，由于采用常壓滅菌技術(shù)，往往出現(xiàn)培養(yǎng)料滅菌前，料袋裝袋后等待滅菌時間超過4 h，這就導(dǎo)致培養(yǎng)料在滅菌前和滅菌開始的起始階段產(chǎn)生厭氧發(fā)酵，這種發(fā)酵程度在35～65 ℃達到高峰，厭氧芽孢桿菌大量繁殖，pH迅速下降到4.0～4.5，同時還伴隨著其他理化和生物指標的劣變，繼而嚴重影響子實體的產(chǎn)量并誘發(fā)病蟲害，造成生產(chǎn)事故，這是目前集約化菌袋生產(chǎn)中急需解決的問題。

本實驗用料袋周轉(zhuǎn)架代替墻式堆疊，確定單柜1萬袋料袋常壓滅菌標準程序，其中，木耳料袋滅菌程序為：2 h升溫至100 ℃，100 ℃保溫12 h，冷卻至60 ℃結(jié)束；香菇料袋滅菌程序為：4 h升溫至100 ℃，在100 ℃保溫24 h，冷卻至60 ℃結(jié)束。新工藝不但與現(xiàn)有菌袋生產(chǎn)工藝相銜接，將木耳和香菇的滅菌工效分別提高了83.3%和60.0%，還有效提升了料袋的質(zhì)量性狀，達到降低成本安全生產(chǎn)的綜合效果，在實際生產(chǎn)中有較大應(yīng)用價值。