干旱脅迫對半夏氮代謝相關酶活性的影響

王彤彤，何志貴，韓蕊蓮，梁宗鎖c*

(1.浙江理工大學，a生命科學學院，b建筑工程學院，c浙江省植物次生代謝調(diào)控重點實驗室，浙江 杭州 310018； 2.桂林旅游學院 酒店管理學院，廣西 桂林 541006)

半夏系天南星科半夏屬草本植物，藥用部位為塊莖，性味辛溫，有毒，歸肺、脾、胃經(jīng)，抗腫瘤，具有重要的藥用價值[1]。在我國西部地區(qū)，干旱是半夏生產(chǎn)中的主要逆境因子之一[2]，影響半夏生長、抗氧化生理指標[3-4]及體內(nèi)有機物的積累，嚴重干旱致使半夏的非生理性倒苗，降低半夏的產(chǎn)量和生物量[5]。此外，干旱脅迫對半夏中的藥用成分的積累和質(zhì)量也產(chǎn)生了顯著影響[6-7]，同時也調(diào)控植物的氮代謝，對半夏的生理過程有著重要的影響。氮代謝在無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮過程中發(fā)揮著重要作用，對植物體內(nèi)各種氨基酸和次生代謝底物的積累有著明顯的影響。半夏生物堿是主要藥用成分之一，干旱對半夏生物堿積累的調(diào)控有著緊密的聯(lián)系。同時，氮素的形態(tài)對半夏的化學成分有著顯著的影響[8-9]，因而研究不同程度土壤干旱對半夏有效成分含量與氮代謝關鍵酶活性的關系，以期從氮代謝方面探討干旱對半夏總生物堿的調(diào)控機制，并了解半夏生物堿的合成與積累的機理，可以為提高半夏的品質(zhì)和有效成分含量提供科學參考依據(jù)。現(xiàn)將有關結(jié)果總結(jié)如下 。

1 材料與方法

1.1 材料

半夏塊莖由甘肅省清水縣農(nóng)業(yè)局試驗基地提供，經(jīng)浙江理工大學生命科學學院梁宗鎖教授鑒定為天南星科植物半夏[Pinelliaternata(Thunb.)Breit]塊莖，2017年3月種于浙江理工大學植物科學樓樓頂，選取長勢和葉型一致的半夏移栽于盛有充分混勻的介質(zhì)(田園土∶沙子為3∶1，V/V)的塑料桶中，每盆10棵，干旱處理通過自然干旱和稱重法進行控制，土壤飽和含水量為25.47%，干旱程度設置按照張紅敏[5]的方法。設置CK為對照組，土壤含水量保持在80%為適宜水分含量；D1組為輕度干旱，土壤含水量為65%左右；D2組為中度干旱，土壤含水量為50%左右。在干旱處理的第7，14，21，28，35天采樣，每個處理組隨機采樣10株，3次重復，進行各項指標測定。分別在第7天和第35天，取半夏塊莖，去皮，烘干，打粉，用于測定總生物堿。

1.2 方法

1.2.1 硝酸還原酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、苯丙氨酸解氨酶活性的測定

1.2.2 總生物堿測定

以鹽酸麻黃堿為對照品，繪制作標準曲線方程Y=0.007 5X+0.025 2 (R2=0.992 4)，橫坐標(X)為鹽酸麻黃堿濃度(μg·mL-1)，縱坐標(Y)為吸光度。稱取半夏塊莖粉末0.5 g，放置三角瓶中，再加10 mL氯仿，0.5 mL濃氨水，冷浸3 h，超聲1 h，過濾提取液，殘渣用10 mL 氯仿洗滌，重復3次(4、3、3 mL)，合并濾液。濾液旋蒸至干，再用氯仿溶解并定容于10 mL 量瓶中。將溶液轉(zhuǎn)移至25 mL分液漏斗中，依次加入10 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH值5.4)和1 mL 0.05%溴麝香草酚藍溶液，充分振搖1 min，靜置萃取1 h，分取氯仿層，水層再用10 mL氯仿萃取兩次，合并氯仿，50 ℃回收至干，用10 mL氯仿洗滌殘留物，重復3次(4、3、3 mL)，濾液轉(zhuǎn)入10 mL量瓶中，氯仿定容，作為供試液[14]。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

所有指標生物學重復測定3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進行統(tǒng)計分析和方差檢驗，結(jié)果以平均值±標準誤差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 干旱脅迫下半夏氮代謝相關酶活性的影響

2.1.1 葉片中NR活性

CK，對照處理；D1，輕度干旱；D2，中度干旱。不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2～4同圖1 干旱脅迫處理時間對半夏葉片NR活性的影響

2.1.2 葉片中GS活性

圖2 干旱脅迫處理時間對半夏葉片GS活性的影響

2.1.3 葉片中GOGAT活性

圖3 干旱脅迫處理時間對半夏葉片GOGAT活性的影響

2.1.4 葉片中PAL活性

PAL是半夏生物堿合成途徑中的重要酶，活性的強弱顯示生物堿合成的強弱。隨著處理時間的延長，PAL的活性逐漸降低。在第7天，D2處理條件下的PAL活性高于CK、D1處理，而在第14天以后，相較于CK，D1和D2處理的PAL活性保持較高的水平。D1和D2處理之間差異不顯著。在第28天，相較于CK，D1和D2處理的PAL活性分別增加了58.27%和53.44%。由圖4可知，在干旱條件下，PAL活性保持較高的水平，有利于半夏生物堿的積累。

圖4 干旱脅迫處理時間對半夏葉片PAL活性的影響

2.2 土壤干旱對半夏總生物堿含量的影響

由圖5可知，在干旱脅迫的第7天，輕度干旱和中度干旱脅迫下半夏塊莖總生物堿要高于適宜水分處理，分別增加了34.10%和37.49%，差異不顯著。在處理的第35天，相較于對照處理，輕度干旱和中度干旱處理下的半夏生物堿含量分別增加了2.23倍和2.28倍。說明，中度和輕度干旱有助于生物堿含量的積累，提高了半夏的質(zhì)量。

圖5 干旱脅迫處理時間對半夏總生物堿含量的影響

3 討論

中度干旱和輕度干旱脅迫下，半夏塊莖積累了較多的總生物堿。在以組培苗作為次生代謝的研究中，半夏組培苗體內(nèi)PAL、GOGAT、GOT活性在外源NO刺激下得到提高，加速了無機氮向有機氮的轉(zhuǎn)化，供給更多的代謝前體物以促進總生物堿積累[20-21]。在半夏愈傷組織中，添加物苯丙氨酸、天冬氨酸、硝普鈉、乙酰水楊酸單獨或兩兩復合，使得氮代謝的關鍵酶以及生物堿含量都有增加，因而推測外源添加物能通過調(diào)節(jié)氮代謝相關酶的變化，從而影響半夏愈傷組織中總生物堿的含量[22]。通過本研究，半夏在輕度干旱和中度干旱的條件下，NR、GOGAT、GS的活性提高，有利于無機氮的轉(zhuǎn)化和有機氮的同化，促進氮代謝的進行，合成次生代謝必要的氨基酸，再通過PAL催化苯丙氨酸，積累較多的次生代謝前提物質(zhì)，從而有利于半夏次生代謝產(chǎn)物的增加。

目前，半夏作為我國重要的藥用植物，其生物堿是重要的天然藥用成分。然而干旱條件下半夏易倒苗、產(chǎn)量降低，同時影響半夏生物堿的積累，本文研究了半夏在干旱脅迫下的生理代謝的變化，結(jié)果表明，中度干旱下半夏氮代謝關鍵酶和PAL活性保持較高的水平，促進氮代謝的進程，有利于生物堿的合成與積累。研究干旱脅迫對半夏生物堿合成與積累的調(diào)節(jié)機理，對提高半夏藥用成分含量有著指導意義，不僅為干旱地區(qū)種植半夏提供理論指導，還對半夏的節(jié)水種植有著積極的生產(chǎn)價值。現(xiàn)階段對半夏生物堿代謝途徑的研究有待完善，半夏的品質(zhì)對其生物堿藥用價值有著重要的聯(lián)系，進一步研究半夏生物堿的合成途徑有著十分重要的意義。