孕期納米銀暴露對(duì)子代小鼠乳腺的影響

孫曉偉，高 慧，董巧香*

(溫州醫(yī)科大學(xué) a檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，b公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，浙江 溫州 325035)

納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺寸(0.1～100 nm)或由其作為基本單元構(gòu)成的材料[1]，與普通材料相比，它在光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)、磁學(xué)、力學(xué)以及化學(xué)等方面具有獨(dú)特的性質(zhì)[2]。納米銀(silver nanoparticles，AgNPs)是1種粒徑小于100 nm的銀單質(zhì)，由于其具有良好的抗菌作用，現(xiàn)已成為應(yīng)用最廣泛的納米產(chǎn)品之一[3-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀具有一定細(xì)胞毒性[5]、肝臟毒性[6]、生殖毒性[7]等生物毒性效應(yīng)。Ivask等[8]在體外實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同粒徑的納米銀可以穿過哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，粒徑越小，毒性越強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，納米銀可以通過Balb/c小鼠的胎盤屏障或通過母乳而傳遞給子代，并引起胚胎的發(fā)育異常[9]。

乳腺干細(xì)胞(mammary stem cells，MaSCs)是一類成體干細(xì)胞，它對(duì)于雌性哺乳動(dòng)物乳腺的發(fā)育十分重要[10]。乳腺上皮細(xì)胞分為基底細(xì)胞群和管腔細(xì)胞群[11]，乳腺干細(xì)胞可以分為基底干細(xì)胞和管腔干細(xì)胞，而乳腺干細(xì)胞的異常有可能會(huì)誘導(dǎo)形成乳腺癌干細(xì)胞，并進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生癌變。

本研究以FVB-GFP小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)孕期小鼠進(jìn)行納米銀暴露，研究納米銀對(duì)子代小鼠乳腺導(dǎo)管和乳腺干細(xì)胞的影響，從而揭示納米銀誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

成年FVB-GFP小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，小鼠飼料和飲用水經(jīng)過嚴(yán)格檢測(cè)，均不含納米銀，可以排除外界因素對(duì)本實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

石蠟切片機(jī)購(gòu)自Leica公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自尼康公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司。

1.1.3 試劑耗材

納米銀、蘇木精、伊紅購(gòu)自Sigma公司；Epicult-B基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Epicult-B Proliferation Supplement、Mammocult基礎(chǔ)培養(yǎng)基和Mammocult Proliferation supplement購(gòu)自Stem Cell公司；氯化銨溶液、0.25% Trypsin-EDTA、DNase I、Dispase和抗鼠CD24-PE抗體購(gòu)自Stem Cell公司；抗人/鼠CD49f-PE/Cy7抗體購(gòu)自Biolegend公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理

將3月齡FVB-GFP雌性小鼠平均分成2組，根據(jù)雌雄比2∶1進(jìn)行合籠，看到陰道栓的當(dāng)天記作懷孕第0 d，懷孕第12～18 d進(jìn)行灌胃處理。將納米銀顆粒放到超純水中，超聲，制成混懸液。處理組每日灌胃50 mg·kg-1納米銀混懸液，對(duì)照組灌胃同樣記錄的超純水[12]。

1.2.2 小鼠臟器及乳腺組織的采集與處理

小鼠麻醉后，頸椎脫臼處死。將小鼠腹部向上固定，用外用手術(shù)刀剪開外皮，取下左側(cè)胸腺處乳腺，放到福爾馬林中，用于石蠟包埋以及病理切片的制備。左側(cè)腹股溝處乳腺在玻片上攤平后放到固定液中用于整體染色，右側(cè)乳腺消化后制成單細(xì)胞懸液。用內(nèi)用手術(shù)刀剪開腹腔膜，取出子宮和肝臟，稱重后，放到福爾馬林溶液中固定。

1.2.3 細(xì)胞流式分選

將組織放到消化液中，恒溫培養(yǎng)消化，依次加入氯化銨、胰蛋白酶、中性蛋白酶和DnaseⅠ，得到單細(xì)胞懸液。分別加入不同熒光素標(biāo)記的CD24-PE、Streptavidin-APC、CD49f-PE/Cy7抗體，分選得到不同的細(xì)胞群：Lin-CD24+CD49fhi基底干細(xì)胞和Lin-CD24hiCD49flo管腔干細(xì)胞。

1.2.4 微球和3D培養(yǎng)

將分選得到的不同細(xì)胞群按照一定比例種在不含血清的培養(yǎng)基中，5 d后形成微球，計(jì)數(shù)并計(jì)算微球形成率。在顯微鏡下挑取約50個(gè)微球重懸于基底膜基質(zhì)中，加入含有血清的培養(yǎng)基，9 d后，觀察并記錄3D結(jié)構(gòu)的形態(tài)和大小。

1.2.5 乳腺增生導(dǎo)管的定量分析

將浸泡在福爾馬林中的乳腺組織用石蠟包埋后，4 μm切片，然后經(jīng)過伊紅-蘇木素染色，可以清晰看到乳腺導(dǎo)管的結(jié)構(gòu)。正常的乳腺導(dǎo)管由2層細(xì)胞構(gòu)成，而增生導(dǎo)管細(xì)胞層數(shù)發(fā)生明顯紊亂。在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)正常和增生導(dǎo)管的數(shù)目，計(jì)算增生導(dǎo)管的比例。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Graphpad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及T檢驗(yàn), 測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)子代小鼠肝臟和子宮的影響

孕期納米銀暴露對(duì)子代小鼠肝臟和子宮的影響見圖1。肝臟指數(shù)可以在一定程度上反應(yīng)藥物的毒性強(qiáng)弱。研究發(fā)現(xiàn)，處理組小鼠肝臟指數(shù)顯著降低，表明納米銀對(duì)小鼠產(chǎn)生了顯著的肝臟毒性效應(yīng)。子宮是雌性哺乳動(dòng)物重要的生殖器官，它對(duì)于乳腺的發(fā)育具有非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。取出小鼠子宮，測(cè)量其長(zhǎng)度和直徑，小鼠子宮的長(zhǎng)度和直徑并無(wú)顯著差異，表明孕期納米銀暴露對(duì)子代小鼠的子宮并沒有產(chǎn)生毒性效應(yīng)。

圖1 小鼠肝臟指數(shù)和子宮形態(tài)變化

2.2 對(duì)子代小鼠乳腺形態(tài)的影響

為了觀察納米銀對(duì)乳腺形態(tài)的影響，用胭脂紅染液對(duì)乳腺組織進(jìn)行整體染色并觀察(圖2)。正常的乳腺導(dǎo)管具有清晰的二級(jí)和三級(jí)分支結(jié)構(gòu)，處理后三級(jí)結(jié)構(gòu)明顯減少。同時(shí)，乳腺組織中的淋巴結(jié)可以表征炎癥反應(yīng)，由圖可以看出處理后淋巴結(jié)面積明顯增大，表明孕期納米銀暴露可以引起子代小鼠的炎癥反應(yīng)。

圖2 小鼠乳腺導(dǎo)管形態(tài)

2.3 對(duì)子代小鼠乳腺病理學(xué)結(jié)構(gòu)的影響

乳腺組織包埋后4 μm切片，經(jīng)過伊紅-蘇木素染色后，可以清晰看到乳腺導(dǎo)管的細(xì)胞組成(圖3)。正常導(dǎo)管由規(guī)則的2層細(xì)胞組成，增生后，細(xì)胞層數(shù)增多。處理后增生導(dǎo)管的比例并沒有發(fā)生明顯的變化。

上述結(jié)果表明孕期納米銀暴露子代乳腺導(dǎo)管并沒有產(chǎn)生明顯的病變。

圖3 小鼠乳腺病理學(xué)結(jié)構(gòu)

2.4 對(duì)子代小鼠乳腺干細(xì)胞組成的影響

根據(jù)不同的細(xì)胞表面標(biāo)記，乳腺干細(xì)胞可以分為2個(gè)不同的細(xì)胞群：基底干細(xì)胞群(Lin-CD24+CD49fhi，MRU)和管腔干細(xì)胞群(Lin-CD24hiCD49flo，CFC)。處理后，基底干細(xì)胞和管腔干細(xì)胞占總?cè)橄偕掀ぜ?xì)胞的比例并沒有發(fā)生明顯變化，表明孕期納米銀暴露并不會(huì)改變子代小鼠乳腺干細(xì)胞的組成(圖4)。

圖4 小鼠乳腺干細(xì)胞組成變化

2.5 對(duì)子代小鼠微球和3D形態(tài)的影響

將分選得到的細(xì)胞群進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)后可以得到乳腺微球結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計(jì)每1 000個(gè)細(xì)胞形成的微球個(gè)數(shù)(圖5)。研究發(fā)現(xiàn)，處理后管腔干細(xì)胞的微球形成率顯著降低，但是基底干細(xì)胞的微球形成率沒有發(fā)生變化。將管腔干細(xì)胞形成的微球重懸于基底膜基質(zhì)中，可以形成3D結(jié)構(gòu)。測(cè)量3D結(jié)構(gòu)的直徑，并統(tǒng)計(jì)空心結(jié)構(gòu)的比例，發(fā)現(xiàn)處理組3D結(jié)構(gòu)的直徑明顯降低，而且空心結(jié)構(gòu)的比例也顯著減少。孕期納米銀暴露可以降低管腔干細(xì)胞的微球形成率，并且影響其3D結(jié)構(gòu)的直徑和形態(tài)。

3 討論

納米銀因其具有廣泛的殺菌作用而應(yīng)用到日常生活的方方面面。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀可以通過口服、皮膚接觸、靜脈注射等多種方式進(jìn)入生物體內(nèi)，并隨著血液循環(huán)運(yùn)輸?shù)缴眢w的其他部位[13]。通過嚙齒類動(dòng)物的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，納米銀可以產(chǎn)生各種生物毒性效應(yīng)，并傳遞給子代[14]。

本研究以FVB-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在懷孕第12～18 d進(jìn)行連續(xù)一周的納米銀暴露。處理后子代小鼠的肝臟指數(shù)發(fā)生了顯著的變化，說(shuō)明納米銀可以產(chǎn)生一定的毒性，但是這種毒性效應(yīng)并沒有影響子宮的形態(tài)發(fā)育。

有研究發(fā)現(xiàn)，乳腺導(dǎo)管的分支結(jié)構(gòu)、密度以及病理學(xué)結(jié)構(gòu)的異常等都有可能成為乳腺組織發(fā)生病變的參考因素[15]。本實(shí)驗(yàn)中，處理后的乳腺導(dǎo)管二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的異常變化，這說(shuō)明，孕期納米銀暴露可能是子代乳腺病變甚至發(fā)生癌變的一個(gè)危險(xiǎn)因素。同時(shí)，淋巴結(jié)面積的增大說(shuō)明機(jī)體產(chǎn)生了炎癥反應(yīng)，表明納米銀可能通過炎癥反應(yīng)使乳腺形態(tài)發(fā)生異常。

在乳腺干細(xì)胞的微球和3D形成實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)納米銀可以影響管腔干細(xì)胞的微球形成率，但是對(duì)基底干細(xì)胞幾乎沒有影響。通過進(jìn)一步的3D重懸培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)納米銀可以顯著減小3D結(jié)構(gòu)的直徑，而且其形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化。

圖5 小鼠乳腺微球和3D結(jié)構(gòu)形態(tài)

孕期是納米銀暴露的一個(gè)敏感窗口。納米銀可以產(chǎn)生肝臟毒性，影響乳腺導(dǎo)管的形態(tài)，對(duì)乳腺干細(xì)胞尤其是管腔干細(xì)胞的發(fā)育與分化具有顯著的影響，這些發(fā)現(xiàn)為乳腺病變或乳腺癌的預(yù)防與治療提供了一定的理論參考價(jià)值，其機(jī)制還有待于我們的進(jìn)一步探索。