營養(yǎng)元素和蛋白聯合干預氟中毒對雌鼠卵巢功能作用

王飛清，夏曙華，鄒文兵，楊 華，喻茂娟

(1.貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，貴陽 550001； 2.貴州醫(yī)科大學附屬烏當醫(yī)院檢驗科，貴陽 550018； 3.貴航300醫(yī)院檢驗科，貴陽 550002； 4.貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，貴陽 550004)

地方性氟中毒(地氟病)是由于長期攝入過量氟而引起的，根據氟源和人體攝氟的不同途徑，大體上可分為飲水型、燃煤污染型、飲茶型三種。燃煤型氟中毒是中國特有的一種氟中毒，其中貴州為受災嚴重地區(qū)之一。其發(fā)病的主要原因是機體攝氟量水平，營養(yǎng)因素和攝氟量之間存在一種疊加效應，氟中毒患病率與營養(yǎng)水平的高低有著密切關系。流行病學報道，除機體高氟直接攝入的危害外，飲食中維生素、蛋白質及礦物質的攝入量不足可加重氟中毒的危害和流行程度。實驗研究發(fā)現，蛋白質、礦物質元素等能改善機體營養(yǎng)，提高機體的抗氟抗病能力，減輕氟中毒對牙齒的損害[1]。本課題組前期研究發(fā)現燃煤型氟中毒可影響雌鼠動情周期、性激素分泌、促進卵泡閉鎖[2-4]。目前對于氟中毒致雌性生殖系統(tǒng)功能的臨床防治干預還未得到足夠的關注，給予營養(yǎng)成分和蛋白飲食是否能拮抗氟中毒對雌鼠卵巢生殖功能毒性研究非常缺乏。通過相關的理論依據，本課題設計以SD雌性大鼠為研究對象，構建雌鼠燃煤型氟中毒動物模型并對其同時添加營養(yǎng)元素和蛋白干預。通過拮抗后，觀察SD雌鼠氟斑牙、尿氟、骨氟、體重變化、各級卵泡、閉鎖卵泡以及黃體數量和形態(tài)變化，凋亡蛋白Bcl-2和Bax表達量。探究鈣、鎂、銅、鋅、維生素D和蛋白對燃煤型氟中毒雌性生殖系統(tǒng)毒性損傷的干預，解析其對燃煤型氟中毒雌性生殖系統(tǒng)毒性損傷干預的機制，為促進對高氟區(qū)女性的生殖健康和生殖內分泌系統(tǒng)影響的防治干預研究奠定一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

以120只斷乳2周體重80 g左右的清潔級SD雌性大鼠為研究對象，由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供[SCXK (黔) 2012-0001]。貴州醫(yī)科大學動物實驗中心動物實驗室環(huán)境溫度20℃ ～ 25℃，濕度(60±20)%，正常明暗交替[SYXK (黔) 2012-0001]。

1.2 主要儀器與試劑

Bcl-2和Bax試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；氟化鈉(優(yōu)質純，成都金山化學試劑有限公司)；營養(yǎng)元素組合片由惠氏制藥有限公司提供。青島海爾集團產海爾-20℃冰箱(BCD-539WE)；奧林巴斯光學工業(yè)株式會社生產Olympus雙目光學顯微鏡；德國Leica公司產EG1150石蠟包埋機；德國Leica公司產Leica RM2135型切片機。

1.3 實驗方法

1.3.1 構建動物模型方法

雌鼠適應性喂養(yǎng)一周，無異常發(fā)現后，根據體重由小到大排序，按隨機數表法分組、編號。隨機分為4組：對照組、染氟組(100 mg/kg)、多種元素組(氟100 mg/kg +營養(yǎng)元素組合片2.08 g/kg)、多種元素+蛋白組(氟100 mg/kg +營養(yǎng)元素組合片2.08 g/kg +蛋白30%)，每組30只，每周調整鼠籠的位置，力求各組大鼠的實驗條件一致。自由飲用自來水，各模型組大鼠自由食用不同配方的病區(qū)原煤加拌泥煤烘烤的玉米飼料。每天動態(tài)觀察大鼠日常情況(毛色、飲水、食用飼料量等)，每周觀察大鼠牙齒的變化并稱重、記錄數據。分別于染氟60，120，180 d處死，每次處死之前連續(xù)10 d每天早上(8:00 ～ 10:00)對雌鼠進行陰道脫落細胞涂片，觀察動情周期變化，于動情期處死大鼠。本實驗經貴州醫(yī)科大學倫理委員會批準實施：1305020，亦經貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，符合動物倫理學要求。研究過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.3.2 免疫組織化學法檢測卵巢顆粒細胞Bcl-2和Bax蛋白

處死雌鼠后，迅速取其一側卵巢，立即放入10%的中性福爾馬林固定液中固定，待固定液浸透后，用鋒利的刀片取大小1 mm左右的卵巢組織，石蠟包埋，常規(guī)切片，免疫組織化學法檢測卵巢顆粒細胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax表達情況。Bcl-2和Bax蛋白定位于細胞漿中，陽性細胞胞漿著色呈棕黃色，不顯棕黃色者為陰性細胞。在高倍鏡下，每張切片隨機取5個視野，計算每個視野下100個細胞中陽性細胞百分比(陽性細胞數/總細胞數)。

1.3.3 HE染色觀察卵巢組織形態(tài)學并記錄各級卵泡

于實驗60，120，180 d動情期股動脈取血處死雌鼠，立即取出卵巢剔除臟器周圍脂肪和結締組織，濾紙吸干表面血液，經10%甲醛溶液固定，每組取10只大鼠卵巢組織進行包埋做形態(tài)學。取材、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。200倍鏡下觀察卵巢組織結構形態(tài)學，且每張切片隨機選取20個高倍鏡視野鏡下計算原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、黃體卵泡、閉鎖卵泡數量變化。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 一般情況與模型構建

陰性對照組雌鼠食欲正常，精神較好，毛色有光澤；模型組雌鼠食欲降低，活動減少，精神萎靡不振，毛色光澤度下降；隨著時間延長多種元素組和多種元素+蛋白組雌鼠與對照組區(qū)別不大，但隨染氟時間的延長染氟組表現加重。模型構建依據課題組前期文獻報道氟斑牙、尿氟和骨氟檢測[5-7]。

2.2 各組卵巢顆粒細胞Bcl-2和Bax蛋白表達情況

2.2.1 Bcl-2蛋白表達情況

各組間和各組內比較，雌鼠卵巢顆粒細胞Bcl-2蛋白表達量差異無顯著性(P> 0.05)，結果見表1和圖1。

2.2.2 Bax蛋白表達情況

相同時間比較(60，120，180 d)：60 d各模型組與對照組比較，雌鼠卵巢顆粒細胞Bax蛋白表達量差異均無顯著性(P> 0.05)。120 d和180 d染氟組雌鼠卵巢顆粒細胞Bax蛋白表達量明顯高于對照組、多種元素組和多種元素+蛋白組，差異均有顯著性(P< 0.05)；多種元素+蛋白組比多種元素組Bax蛋白表達量低，且180 d比較差異有顯著性(P< 0.05)。結果見表1和圖2。

各組內比較，染氟組雌鼠卵巢顆粒細胞Bax蛋白表達量逐漸增多，60 d明顯低于120 d、180 d，且差異均有顯著性(P< 0.05)。多種元素組和多種元素+蛋白組Bax蛋白表達量逐漸增多，且多種元素組60 d與180 d比較，差異有顯著性(P< 0.05)；多種元素+蛋白組組內之間表達差異無顯著性(P> 0.05)，結果見表1和圖2。

2.3 各組雌鼠卵泡及黃體的情況

對照組和各染氟組雌鼠卵巢外觀色澤鮮紅，光鏡下卵巢組織結構形態(tài)正常，均可見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，顆粒細胞呈單層或多層排列，排列整齊。染氟組隨時間延長，卵巢顆粒細胞呈現漸進性水腫的變化，閉鎖的卵泡和黃體退化逐漸增多，成熟卵泡明顯減少。多種元素組隨時間延長，卵巢顆粒細胞呈現輕中度水腫，閉鎖的卵泡和黃體退化低于染氟組，可見成熟卵泡。多種元素+蛋白組隨時間延長，卵巢顆粒細胞少見輕度水腫，閉鎖的卵泡和黃體退化程度低于染氟組，可見成熟卵泡。見圖3。

各組間雌鼠的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、黃體數量差異均無顯著性(P> 0.05)。各組間雌鼠閉鎖卵泡數量比較：60 d對照組、多種元素+蛋白組與染氟組比較，差異有顯著性(P< 0.05)。120 d和180 d染氟組閉鎖卵泡數量明顯高于對照組、多種元素組、多種元素+蛋白組，差異有顯著性(P< 0.05)。各時間點干預組與對照組比較，差異均無顯著性(P> 0.05)。各組內比較，隨時間延長，閉鎖卵泡數量差異均無顯著性(P> 0.05)。結果見表2。

表1 各組雌鼠Bcl-2和Bax蛋白表達量Table 1 Bcl-2 and Bax expression of the female rats in each group

注：相同時間組間比較，*P< 0.05；與多種元素組比較，△P< 0.05；相同劑量組間比較，◇P< 0.05；與180 d比較，○P< 0.05。

Note. Comparison among groups at the same time,*P< 0.05. Compared with the various elements group,△P< 0.05. Comparison among groups with the same dose,◇P< 0.05. Compared with 180 d,○P< 0.05.

注：A：對照組；B：染氟組；C：多種元素組；D：多種元素+蛋白組。圖1 180 d雌鼠卵巢顆粒細胞Bcl-2表達(× 200)Note. A: Control group; B: Fluorosis group; C: Various elements group; D: Various elements + protein group.Figure 1 Bcl-2 expression in ovarian granulosa cells at 180 days in female rats

注：A：對照組；B：染氟組；C：多種元素組；D：多種元素+蛋白組。圖2 180 d雌鼠卵巢顆粒細胞Bax表達(× 200)Note. A: Control group; B: Fluorosis group; C: Various elements group; D: Various elements + protein group.Figure 2 Bax expression in ovarian granulosa cells in 180 days in female rats

組別Groups天數(d)Days原始卵泡數量Number of primordial follicles初級卵泡數量Number of primary follicles次級卵泡數量Number of secondary follicles黃體數量Number of corpora lutea閉鎖卵泡數量Number of follicle atresia對照組Control group6016.1±3.98.7±1.85.3±1.618.2±4.819.8±4.4*12016.7±2.87.3±2.15.6±1.722.2±4.619.2±3.9*18016.9±3.67.9±2.06.5±1.619.1±4.519.6±4.4*染氟組Fluorosis group6016.5±3.38.2±1.66.6±1.318.7±3.724.6±5.2 12015.9±3.18.3±1.55.9±1.319.6±3.325.4±4.118016.2±4.37.8±1.75.7±1.618.6±4.526.1±5.3多種元素組Various elements group6016.4±3.97.8±1.56.2±1.719.3±4.921.5±4.2 12017.4±3.07.4±2.26.2±1.820.8±4.520.6±3.3*18016.7±3.97.4±2.15.8±2.118.8±3.121.2±3.3*多種元素+蛋白組Various elements + protein group6017.2±2.79.2±1.65.8±1.819.1±3.820.4±4.2*12016.3±3.08.2±2.15.6±2.121.6±3.519.2±3.1*18016.6±3.08.8±2.16.4±1.919.7±3.720.9±4.3*

注：與染氟組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the fluorosis group,*P< 0.05.

注：A：對照組；B：染氟組；C：多種元素組；D：多種元素+蛋白組。圖3 180 d雌鼠卵巢組織形態(tài)(× 200)Note. A: Control group; B: Fluorosis group; C: Various elements group; D: Various elements + protein group.Figure 3 Ovarian tissue morphology at 180 days in female rats

3 討論

實驗研究發(fā)現，氟中毒可引起凋亡蛋白表達增高，促進細胞凋亡發(fā)生[8]。而鈣、鎂、銅、鋅很早已被人們作為拮抗氟中毒的主要營養(yǎng)元素之一，科提高機體抗氧化力，拮抗氟對機體毒性損傷和細胞凋亡[9-10]。文獻報告，鋅和銅可增加男性生殖細胞對氧化應激的耐受性，降低生精細胞的凋亡[11]。鈣、鎂、銅等參與機體抗氧化酶合成同時，可降低凋亡蛋白Bax的表達，這已在神經元和雄性精子的抗氟抗氧化損傷作用得到實驗論證[12-13]。本實驗結果顯示，兩干預組Bcl-2蛋白表達量與對照組相比無明顯差異，與染氟組比較有所升高，但差異無顯著性，表明染氟和營養(yǎng)因素對蛋白Bcl-2表達量影響不大。實驗結果進一步顯示，染氟組Bax蛋白表達量明顯增加，而添加營養(yǎng)成分干預，兩干預組Bax蛋白表達量與染氟組比較明顯降低。兩干預組間比較，Bax蛋白表達差異無顯著性。通過干預，兩干預組Bax蛋白表達量與對照組比較差異無顯著性，顯示鈣、鎂、銅、鋅、維生素D和蛋白可降低氟中毒卵巢顆粒細胞Bax蛋白表達。本實驗初步探討氟對雌性生殖系統(tǒng)毒性機制和干預情況，為今后對氟病區(qū)女性生殖毒性防治和治療起到重要意義。

卵泡退化主要因素與卵巢顆粒細胞的凋亡密切相關[14]。本實驗結果顯示，高劑量氟可促進卵巢顆粒細胞的凋亡，且光鏡結果顯示閉鎖卵泡和退化黃體增多，這與本實驗組前期報到高氟對卵巢損傷相符[15]。實驗研究報道，卵巢顆粒細胞和卵泡膜細胞分布豐富維生素D受體，給予維生素D可調節(jié)卵巢功能[16]。本實驗結果顯示，兩干預組與對照組比較，原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡及黃體數量均未產生明顯的影響。多種元素組和多種元素+蛋白組卵巢顆粒細胞少見輕度水腫，正常的各級卵泡多見，閉鎖的卵泡和退化的黃體明顯低于染氟組，且從形態(tài)學比較兩干預組效果差異不明顯。結果還發(fā)現，兩干預組與對照組比較閉鎖卵泡數量無明顯差異，與染氟組比較逐漸降低，差異有顯著性，顯示鈣、鎂、銅、鋅、維生素D和蛋白可拮抗氟對卵泡細胞毒性作用，兩干預組間卵巢組織形態(tài)和卵泡數量無明顯差異，提示與干預時間長短和干預因素無明顯相關性，這與本課題組前期研究報道卵巢顆粒細胞超微結構的改變相符[17]。

綜上所述，本研究顯示高劑量的氟對雌鼠卵巢生殖功能存在明顯毒性作用，表現為卵巢顆粒細胞促凋亡蛋白Bax表達明顯增高，光鏡下卵巢顆粒細胞明顯水腫、閉鎖卵泡增加、黃體退化，明顯影響卵泡發(fā)育。添加鈣、鎂、銅、鋅、維生素D和蛋白干預氟中毒對卵巢組織毒性作用，結果顯示上述干預因素可使染氟所致卵巢顆粒細胞促凋亡蛋白Bax表達顯著降低，光鏡下閉鎖卵泡的數量明顯降低，各階段發(fā)育卵泡可見；在添加鈣、鎂、銅、鋅、維生素D基礎上加入蛋白，可使雌鼠卵巢顆粒細胞凋亡蛋白Bax表達和閉鎖卵泡數量降低，且隨干預時間延長，效果更佳。