妊娠小鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射人腫瘤HepG2細(xì)胞對(duì)胎鼠生長發(fā)育的影響

李?yuàn)檴?，?昀，陳 來，李 俊，陳麗玲，曾文婷，袁可望，舒 坤，徐 彭，羅小泉

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330004)

腫瘤研究中，新療法、新藥物并未顯著改善癌癥患者的治療和預(yù)后的一個(gè)重要原因是臨床前腫瘤動(dòng)物模型不能很好地預(yù)測臨床試驗(yàn)效果。在現(xiàn)有腫瘤動(dòng)物模型中，腫瘤瘤株與人腫瘤之間不可避免的種屬差異，是導(dǎo)致動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果與臨床治療人腫瘤的實(shí)際情況相差較遠(yuǎn)的根本原因，從這個(gè)角度出發(fā)，人腫瘤的異種移植模型無疑是最具有應(yīng)用價(jià)值和前景的。而現(xiàn)有成熟的異種移植模型以先天免疫系統(tǒng)組成成分缺陷的動(dòng)物作為載體的人源腫瘤模型存在一個(gè)重要的先天缺陷：即其搭載動(dòng)物為免疫缺陷小鼠，在允許異種人腫瘤存活的同時(shí)，先天缺失抗腫瘤免疫反應(yīng)，這意味著無法采用該模型研究移植腫瘤與特異性免疫系統(tǒng)的相互作用和評(píng)估免疫治療方法及藥物的作用效果[1-2]，限制了近年來活躍的腫瘤免疫治療及其基礎(chǔ)研究。因此，建立既能保留人體腫瘤生物學(xué)特性，又具有正常免疫功能的動(dòng)物模型是腫瘤研究尤其是腫瘤免疫研究的迫切需要。本研究擬建立可適用于病人來源的，且免疫功能相對(duì)正常的人腫瘤異種移植動(dòng)物模型，從而為腫瘤研究，尤其是腫瘤免疫研究提供新的臨床前研究模型。KM小鼠由于繁殖周期短、多胎妊娠和抵抗力強(qiáng)，是常用的宮內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)對(duì)象。本文在前期工作的基礎(chǔ)上[3]繼續(xù)探討了妊娠小鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射人腫瘤HepG2細(xì)胞對(duì)胎鼠成活率和生長發(fā)育的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，8周齡，體重30 ～ 40 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK (湘) 2013-0004]。雌鼠經(jīng)配種、生產(chǎn)后備用。飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心[SYXK (贛) 2017-0004]。實(shí)驗(yàn)獲得江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(倫理審查證號(hào)：JZLLSC2017-0021)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞購自上海細(xì)胞研究所，由江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(批號(hào)為922L035)，購自德國默克制藥公司；鹽酸布比卡因(批號(hào)為D1102A)，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；通用型中性組織固定液(4%多聚甲醛)(批號(hào)為175030)，購自武漢賽維爾生物科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(批號(hào)為20171108)，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(含雙抗，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)(批號(hào)為20170812)，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；胎牛血清(批號(hào)為RY3201)，購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；胰蛋白酶(批號(hào)為T1300)，購自北京索萊寶科技有限公司；臺(tái)盼藍(lán)染液(批號(hào)為20161122)，購自北京索萊寶科技有限公司。拉制儀(型號(hào)為PC-1)，購自日本成茂公司；微量注射器(型號(hào)為IM-9B)，購自日本成茂公司；恒溫臺(tái)(型號(hào)為TP-SMZSL)，購自日本東海希多公司；CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)為C150)，購自德國賓德有限責(zé)任公司；全自動(dòng)脫水機(jī)(型號(hào)為HistoCore Pearl)，購自德國徠卡儀器有限公司；包埋機(jī)(型號(hào)為Arcadia)，購自德國徠卡儀器有限公司；切片機(jī)(型號(hào)為RM2235)，購自德國徠卡儀器有限公司；染色封片工作站(型號(hào)為AutostainerXL + TS5015 + CV5030)，購自德國徠卡儀器有限公司；五人共覽顯微鏡(型號(hào)為DM2500B)，購自德國徠卡儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，移入培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱，于37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。注射前于倒置顯微鏡下采用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)活細(xì)胞數(shù)，用PBS調(diào)整細(xì)胞懸液至不同濃度：2.5 × 107/mL、5 × 107/mL和7.5 × 107/mL，即時(shí)備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、手術(shù)及術(shù)后觀察

選取雄性種鼠和經(jīng)產(chǎn)的雌性種鼠，在交配前分開隔離飼養(yǎng)。下午1∶1合籠，第二天檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)天定為0 d。孕鼠隨機(jī)分為5組，于孕14 d開腹腔行子宮內(nèi)注射，即向每只胎鼠腹腔注射10 μL不同濃度的HepG2細(xì)胞懸液，對(duì)照組注射等量無菌PBS溶液，全部胎鼠注射完成后縫合，假手術(shù)組孕鼠只開腹腔不進(jìn)行胎鼠腹腔注射，直接縫合。

手術(shù)具體方法如下：孕鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉溶液(70 mg/kg)麻醉，放置在恒溫臺(tái)上，仰臥，固定。75%酒精消毒并剃光腹部毛發(fā)。下腹部做1 cm的縱向切口，用濕潤棉簽輕輕舒展筋膜，并將妊娠子宮從切口中牽出，確定左、右卵巢，記錄胎鼠數(shù)量后將子宮放回腹腔。其后逐只牽出進(jìn)行注射，注射針頭由外徑1 mm的毛細(xì)玻璃管拉制，術(shù)中不斷用37°C預(yù)熱生理鹽水濕潤子宮。記錄胎鼠注射可能出現(xiàn)的出血、囊液滲出、囊膜外突、胎鼠損傷等手術(shù)并發(fā)癥。注射完成后，小心抽離注射針，將胎鼠小心放回腹腔。用5-0編織可吸收縫線縫合筋膜，5-0不可吸收縫線縫合皮膚。于切口處皮下注射0.05%鹽酸布比卡因溶液(5 mg/kg)以減少孕鼠痛苦。將孕鼠放置在保溫臺(tái)上保持體溫，直至其醒來。醒來后轉(zhuǎn)移至鋪有厚紗布的籠具里，并置于安靜的區(qū)域直到生產(chǎn)。

第二天檢查孕鼠有無陰道出血、腹部收縮或煩躁等流產(chǎn)征兆。其后每天觀察，注意傷口紅腫、發(fā)炎、傷口分離和感染等癥狀。記錄每組孕鼠分娩及胎鼠成活情況。

1.3.3 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠的出生后生長發(fā)育指標(biāo)測定

考察出生后存活的乳鼠發(fā)育狀況，包括觀察是否存在外觀畸形，定期稱重，并記錄耳廓分離、牙萌出、出毛、睜眼時(shí)間、張耳、雄性睪丸下降、雌性陰道開口等一般生理發(fā)育和運(yùn)動(dòng)發(fā)育、神經(jīng)肌肉發(fā)育、反射和感覺功能等特殊生理發(fā)育指標(biāo)的達(dá)標(biāo)時(shí)間[4-6]。

選取成年后部分小鼠，摘眼球取血后，解剖觀察肝、肺、腎等主要臟器有無畸形、病變，并取心、肝、肺、腎、胃、十二指腸、空腸、回腸和盲腸，用4%多聚甲醛組織固定液固定，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，HE染色，顯微觀察各組小鼠主要臟器的病理改變情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)并發(fā)癥

孕鼠中除1只因術(shù)中麻醉過量死亡外，其余孕鼠均未發(fā)現(xiàn)感染跡象，每只孕鼠妊娠胎鼠個(gè)數(shù)為2 ～ 18只，孕鼠及胎鼠具體情況見表1。

除假手術(shù)組外，各組均出現(xiàn)出血、囊液滲出、囊膜外突等手術(shù)并發(fā)癥，各組總并發(fā)癥較假手術(shù)組差異均有顯著性(P< 0.01)，2.5 × 105細(xì)胞注射組囊液滲出、囊膜外突并發(fā)癥與假手術(shù)組間比較差異有顯著性(P< 0.01)，對(duì)照組囊液滲出并發(fā)癥、7.5 × 105細(xì)胞注射組囊液滲出、囊膜外突并發(fā)癥與假手術(shù)組相比差異有顯著性(P< 0.05)。與對(duì)照組相比，2.5 × 105細(xì)胞注射組和7.5 × 105細(xì)胞注射組總并發(fā)癥有所增加，差異有顯著性(P< 0.01)，2.5 × 105細(xì)胞注射組囊液滲出、囊膜外突并發(fā)癥與對(duì)照組相比差異有顯著性(P< 0.01)，7.5 × 105細(xì)胞注射組囊膜外突并發(fā)癥與對(duì)照組相比差異有顯著性(P< 0.05)。見表1。

表1 手術(shù)孕鼠、胎鼠情況及各組手術(shù)并發(fā)癥的比較Table 1 Comparison of conditions and complications of pregnant and fetal mice during operation in each group

注：與假手術(shù)組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與對(duì)照組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01。

Note. Compared with the sham operation group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group,△P< 0.05,△△P< 0.01.

2.2 妊娠結(jié)局

因正常KM小鼠生產(chǎn)在孕18 ～ 20 d之間，故將生產(chǎn)天數(shù)少于18 d孕鼠認(rèn)定為早產(chǎn)孕鼠；術(shù)后觀察有流產(chǎn)跡象且超出孕26 d仍未生產(chǎn)孕鼠認(rèn)定為流產(chǎn)孕鼠。

各注射組的胚胎丟失率較假手術(shù)組高，差異均有顯著性(P< 0.01)。細(xì)胞注射組與對(duì)照組相比，胚胎丟失率有所增加，其中7.5 × 105細(xì)胞注射組較對(duì)照組差異有顯著性(P< 0.05)(見表2)。

2.3 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠的發(fā)育狀況

結(jié)果表明，各細(xì)胞注射組順利分娩的胎鼠與假手術(shù)組相比，差異無顯著性。對(duì)照組與假手術(shù)組相比，雖差異無顯著性，但體重有所增加(見圖1)。

表2 各組孕鼠妊娠結(jié)局的比較Table 2 Comparison of pregnancy outcomes of mice in each group

注：與假手術(shù)組比較，**P< 0.01；與對(duì)照組比較，△P< 0.05。

Note. Compared with the sham operation group,**P< 0.01. Compared with the control group,△P< 0.05.

圖1 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠出生后體質(zhì)量增長情況Figure 1 Body mass of fetal mice with in utero intraperitoneal injection after birth

經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射并順利分娩的胎鼠，出生時(shí)無形態(tài)缺陷，新生鼠繼續(xù)發(fā)育至成年，其一般發(fā)育指標(biāo)、特殊發(fā)育指標(biāo)，與假手術(shù)組相比無明顯變化，7.5 × 105細(xì)胞注射組胎鼠的耳廓分離、雄性睪丸下降、爬行、聽覺驚愕和空中翻正反射時(shí)間較假手術(shù)組有所延長，但差異均無顯著性(見表3、表4)。肉眼和HE染色、鏡下觀察表明所有注射組各主要臟器的發(fā)育正常，未見異常結(jié)構(gòu)及細(xì)胞(見圖2 ～ 10)。

表3 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠出生后的一般生理發(fā)育指標(biāo)(出生后天數(shù))Table 3 General physiological functions of fetal mice with in utero intraperitoneal injection after birth (postnatal days)

表4 經(jīng)子宮內(nèi)腹腔注射胎鼠出生后的特殊生理發(fā)育指標(biāo)(出生后天數(shù))Table 4 Specialized physiological functions of fetal mice with in utero intraperitoneal injection after birth (postnatal days)

注：A：假手術(shù)組；B：對(duì)照組；C：細(xì)胞注射組(2.5 × 105)；D：細(xì)胞注射組(5.0 × 105)；E：細(xì)胞注射組(7.5 × 105)。下圖同。圖2 各組順利分娩胎鼠成年后心臟病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Note. A: Sham operation group; B: Control group; C: HepG2 cell injection group (2.5 × 105); D: HepG2 cell injection group (5.0 × 105); E: HepG2 cell injection group (7.5 × 105). The same in the following figures.Figure 2 Histopathological observation of heart tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖3 各組順利分娩胎鼠成年后肝臟病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 3 Histopathological observation of liver tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖4 各組順利分娩胎鼠成年后肺臟病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 4 Histopathological observation of lung tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖5 各組順利分娩胎鼠成年后腎臟病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 5 Histopathological observation of kidney tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖6 各組順利分娩胎鼠成年后胃病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 6 Histopathological observation of stomach tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖7 各組順利分娩胎鼠成年后十二指腸病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 7 Histopathological observation of duodenum tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖8 各組順利分娩胎鼠成年后空指腸病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 8 Histopathological observation of jejunum tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖9 各組順利分娩胎鼠成年后回指腸病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 9 Histopathological observation of ileum tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

圖10 各組順利分娩胎鼠成年后盲指腸病理學(xué)觀察(HE染色，× 200)Figure 10 Histopathological observation of cecum tissue from the grown-up fetal mice after successful delivery in each group. HE staining

3 討論

1948年，Medawar等[7]通過向一種小鼠子宮內(nèi)注射另一種小鼠的細(xì)胞，即在胚胎時(shí)期接觸外來抗原，使前者出生后小鼠對(duì)后者的排斥反應(yīng)消失，并首次提出“獲得性免疫耐受”概念。這為器官移植領(lǐng)域的研究者打開了大門，讓其看到了具有正常免疫功能的機(jī)體接納特定非己抗原特性活體細(xì)胞、器官的可能性。其后，對(duì)“獲得性免疫耐受”的機(jī)制研究表明：在胚胎時(shí)期，體內(nèi)已有針對(duì)多種抗原的具有免疫活性的淋巴細(xì)胞克隆，此時(shí)若與某種抗原(包括自身的或人工導(dǎo)入的)相遇，與其對(duì)應(yīng)的淋巴細(xì)胞克隆即被破壞或抑制，出生后只對(duì)胚胎期曾接觸過的抗原形成耐受，而對(duì)胚胎時(shí)期從未接觸過的抗原仍有免疫應(yīng)答[8]。研究表明，采用子宮內(nèi)注射異體、甚至異種細(xì)胞的方法，可誘導(dǎo)免疫耐受[9-10]，并在移植排斥研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[11]。本研究基于此原理，擬通過向孕鼠子宮內(nèi)的胎鼠注射人源細(xì)胞，建立免疫功能相對(duì)正常的人腫瘤異種移植動(dòng)物模型，從而為腫瘤研究，尤其是腫瘤免疫研究提供新的臨床前研究模型。

基于上述觀點(diǎn)或假定，本研究需建立KM小鼠子宮內(nèi)注射方法。在注射部位的選擇上，劉英等[12]采用胎鼠腹腔注射成功地建立了人臍血造血干細(xì)胞宮內(nèi)移植的小鼠模型，其推測宿主腹腔的間皮細(xì)胞可起到支架基質(zhì)作用，并把造血干細(xì)胞不斷地輸送到血循環(huán)。據(jù)此，本研究采用了胎鼠腹腔注射，通過前期實(shí)驗(yàn)確定了注射時(shí)間為孕14 d，并采用了生育耐受性、適應(yīng)性和經(jīng)驗(yàn)上都優(yōu)于初產(chǎn)孕鼠的經(jīng)產(chǎn)孕鼠。

因?yàn)閻盒阅[瘤細(xì)胞和胚胎組織一樣，呈現(xiàn)旺盛的增殖能力，需先考察注射人腫瘤細(xì)胞是否會(huì)對(duì)胎鼠的發(fā)育產(chǎn)生影響，因此本研究擬先考察注射人腫瘤細(xì)胞對(duì)胎鼠的發(fā)育的影響?？紤]到其后研究中胎鼠接觸異種抗原細(xì)胞的數(shù)量是出生后胎鼠的免疫功能及耐受情況的重要影響因素，本研究設(shè)置了不同濃度的人肝癌HepG2細(xì)胞注射組[13-14]，并設(shè)假手術(shù)組及對(duì)照組，記錄手術(shù)情況及孕鼠生產(chǎn)情況，以及出生小鼠的體重，并對(duì)子代鼠的耳廓分離、上下牙萌出、全身絨毛、睜眼時(shí)間、張耳、雄性睪丸下降、雌性陰道開口等一般生理發(fā)育學(xué)指標(biāo)和爬行、前肢懸掛、斷崖回避反射、聽覺驚愕、平面翻正反射、空中翻正反射等特殊生理發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，選取成年小鼠解剖觀察肝、肺、腎等主要臟器有無畸形、病變，并取材進(jìn)行HE染色，顯微觀察各組小鼠主要臟器的病理改變情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，孕鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射組的術(shù)中總并發(fā)癥顯著增加；與對(duì)照組相比，個(gè)別細(xì)胞注射組的囊液滲出、囊膜外突并發(fā)癥顯著增加，這可能是導(dǎo)致細(xì)胞注射組較對(duì)照組胚胎丟失率有所增加的原因之一。各濃度細(xì)胞注射組子代鼠的體重和生長發(fā)育指標(biāo)差異無顯著性，肉眼觀察各主要臟器無病變，顯微觀察未見異常結(jié)構(gòu)。其中對(duì)照組及部分細(xì)胞注射組與假手術(shù)組相比，雖差異無顯著性，但體重有所增加的原因可能是對(duì)照組較假手術(shù)組胚胎丟失率高，存活的子代鼠少，哺乳期從母鼠獲得的營養(yǎng)相對(duì)較多。

在本實(shí)驗(yàn)確定孕鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射人腫瘤HepG2細(xì)胞對(duì)胎鼠發(fā)育影響的基礎(chǔ)上，后續(xù)實(shí)驗(yàn)還將系統(tǒng)考察子宮注射人源細(xì)胞的數(shù)量及時(shí)間對(duì)順利出生胎鼠的荷瘤能力和免疫系統(tǒng)功能的影響，以確定胚胎期經(jīng)人源腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)特異性免疫耐受的小鼠，是否具備正常免疫力，且獨(dú)能允許胚胎時(shí)期接觸過的腫瘤細(xì)胞生長。

在孕鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射后出現(xiàn)的流產(chǎn)等非正常生產(chǎn)受操作技術(shù)影響較大，術(shù)中操作不當(dāng)、過度壓迫胚胎、子宮復(fù)位不好壓迫供血血管、孕鼠術(shù)后疼痛不適和各種原因造成的手術(shù)時(shí)間過長均會(huì)導(dǎo)致手術(shù)成功率及胎鼠存活率的下降。為減少并發(fā)癥的發(fā)生，提高手術(shù)成功率，本課題組總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，采取了以下措施：①相較于子宮內(nèi)胎鼠注射現(xiàn)普遍采用的微量注射器，本研究用小直徑(1 mm)玻璃毛細(xì)管拉制極細(xì)的針頭，使進(jìn)針損傷降至最低。②手術(shù)中對(duì)胚胎進(jìn)行操作時(shí)要格外注意，如固定胚胎時(shí)注意捉持力度，在保證準(zhǔn)確進(jìn)針的前提下盡可能輕柔；胚胎放回腹腔時(shí)用預(yù)熱生理鹽水濕潤，減少對(duì)胚胎的擠壓。③術(shù)后注射鎮(zhèn)痛藥，減少孕鼠的疼痛，緩解不適，保證術(shù)后的保暖和護(hù)理措施到位。整個(gè)手術(shù)過程嚴(yán)格無菌操作，以及不斷練習(xí)提高和熟練實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)也是降低流產(chǎn)、早產(chǎn)的發(fā)生，提高手術(shù)成功率的重要保證。

通過以上實(shí)驗(yàn)，本課題組確認(rèn)了孕鼠子宮內(nèi)胎鼠腹腔注射人腫瘤HepG2細(xì)胞不會(huì)對(duì)胎鼠發(fā)育產(chǎn)生影響，同時(shí)提高了子宮內(nèi)注射操作的技術(shù)水平，為后續(xù)繼續(xù)研究模型小鼠的荷瘤情況和免疫功能打下了基礎(chǔ)。