他克林體外抗細粒棘球蚴作用研究

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包蟲病又稱棘球蚴病(Echinococcosis)，是由棘球絳蟲中絳期幼蟲感染所致的重要人獸共患疾病。目前，細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)和多房棘球絳蟲(E.multilocularis)是兩種最為重要的致病病原，呈世界性分布[1-2]。我國首次包蟲病全國流行病學調查結果顯示，我國包蟲病流行范圍廣，患病數(shù)量和疾病負擔均居全球首位[3]。人們通過誤食蟲卵污染的水源和食品等感染，棘球蚴囊可產(chǎn)生占位性病變，其中多房棘球蚴可直接浸潤肝組織，使患者肝功能嚴重受損，隨著病程的發(fā)展，棘球蚴病嚴重危害患者生命健康，甚至導致死亡[1]。目前，該病的臨床化療藥物較為局限，僅有甲苯達唑(mebendazole)和阿苯達唑兩種，且治愈率均不高[4]，因此尋找新的治療藥物或者治療方案是目前亟待解決的科學問題。

近年來，一些廣譜抗寄生蟲藥物和抗癌藥物被報道具有潛在的抗棘球蚴作用，可觀察到其體內外對細粒棘球蚴和多房棘球蚴的作用效果[5-6]。本課題組前期亦對一些臨床藥物的抗棘球蚴效果進行了評價，從中發(fā)現(xiàn)了多個潛在的治療包蟲病藥物。本研究對臨床治療阿爾茲海默病藥物—他克林(Tacrine)在體外對細粒棘球蚴作用進行了觀察。

1 材料與方法

1.1蟲體和實驗動物 昆明小鼠體重(20±2)g購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。細粒棘球蚴原頭節(jié)來源于青海自然感染的綿羊細粒棘球蚴囊，從囊液中取出的原頭節(jié)用生理鹽水清洗5～8次后棄去囊液及殘留的囊壁組織。用0.1%的亞甲基藍溶液對原頭節(jié)進行染色，并在倒置顯微鏡下觀察其活性，其中死亡的原頭節(jié)被染成深色，原頭節(jié)活性大于95%的用于后續(xù)的研究。用含有500 U雙抗的生理鹽水調整細粒棘球蚴原頭節(jié)密度為4 000個/ mL，向昆明小鼠腹腔注射0.5 mL原頭節(jié)懸液，模型建立8個月以上可用于生發(fā)層細胞的分離。

1.2主要試劑 他克林和甲苯達唑均購自于美國Sigma公司， RPMI 1640培養(yǎng)基和其他細胞培養(yǎng)相關試劑為美國Gibco公司產(chǎn)品，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自上海林峰化學試劑有限公司，亞甲基藍(methylene blue)購自上海三愛思試劑有限公司，CCK-8試劑盒購自于日本Dojondo公司。

1.3細粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細胞體外培養(yǎng) 將細粒棘球蚴原頭節(jié)加入完全培養(yǎng)基(PRMI 1640培養(yǎng)基中包含10%胎牛血清、10%囊液、2 mmol/L谷氨酸、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素)中，在5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)，每4～5天換液1次。按照每200 μL培養(yǎng)基包含50～200個原頭節(jié)加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜后用于藥效觀察實驗。解剖細粒棘球蚴感染的昆明小鼠，取出其腹腔內的囊，用生理鹽水清洗3～5次后經(jīng)37 ℃的2.5%胰酶消化10～30 min后以500 ×g離心5 min后棄上清并加入完全培養(yǎng)基調整生發(fā)層細胞密度至5×104個/mL，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，每2～3 d換液1次。將培養(yǎng)后的生發(fā)層細胞懸液按照1×104個/200 μL加入96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜貼壁后可用于藥效觀察實驗。

1.4細粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細胞體外給藥方案 用DMSO配制的濃度為4、8、10、20和40 μg/mL的他克林分別同細粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細胞在5% CO2，37 ℃條件下進行孵育，同時以0.5% DMSO作為空白對照。孵育3 d后的原頭節(jié)用0.1%的亞甲基藍溶液染色并在倒置顯微鏡下計數(shù)，分別記錄死亡原頭節(jié)數(shù)和原頭節(jié)總數(shù)，計算原頭節(jié)死亡率。原頭節(jié)死亡率(%)=(死亡原頭節(jié)數(shù)目/原頭節(jié)數(shù)目總和)×100%。生發(fā)層細胞的活性用CCK-8試劑盒測定，計算細胞活性抑制率。細胞抑制率(%)=[(對照細胞活性-藥物作用后細胞活性)/對照組細胞活性]×100%。

1.5透射和掃描電子顯微鏡觀察 將40 μg/mL 他克林作用后的原頭節(jié)和生發(fā)層細胞置于2.5%的戊二醛4 ℃固定過夜。透射電鏡實驗步驟：用PBS清洗3次，用2%的鋨酸4度固定2 h，再用PBS清洗3次(每次15 min)，分別用50%、70%、80%和90%乙醇梯度脫水各15 min，再用100%乙醇脫水3次(每次20 min)，丙酮置換2次(每次15 min)后用丙酮：包埋劑(體積比)=2∶1的浸漬液浸漬4 h，再用丙酮：包埋劑(體積比)=1∶2的浸漬液浸漬4 h，用純包埋劑浸漬2次(每次12 h)。將樣品放入盛有純包埋劑的包埋板中置于65 ℃條件下聚合48 h以上，修理包埋頭后制備厚度為70 nm的包埋切片，用乙酸雙氧鈾染色10 min，用檸檬酸鉛染色10 min后上機檢測。掃描電鏡實驗步驟：用PBS清洗3次(每次10 min)，分別用30%、50%、70%、80%和90%乙醇梯度脫水各15 min，再用100%乙醇脫水3次(每次15 min)，叔丁醇置換3次(每次30 min)后，用真空冷凍干燥機干燥樣品過夜。將樣品用導電膠帶粘到樣品臺上，用離子濺射儀鍍10 nm金膜后上機檢測。

2 結 果

2.1他克林對細粒棘球蚴原頭節(jié)的體外作用效果

在倒置顯微鏡下觀察0.1%亞甲基藍染色后的原頭節(jié)以判斷其活性，其中對照組中的原頭節(jié)經(jīng)DMSO作用3 d后活性仍然較高(94.28±2.31%)，其形態(tài)未見明顯的改變(圖1A，2A)。不同濃度他克林對細粒棘球蚴原頭節(jié)活性的影響可見圖1A，經(jīng)20 μg/mL和40 μg/mL的他克林作用3 d后，原頭節(jié)的死亡率高達100%，其中死亡原頭節(jié)的體壁出現(xiàn)輕微腫脹伴隨著外部輪廓的消失(圖2B)。但當藥物作用濃度降低至10 μg/mL以下時，未發(fā)現(xiàn)對原頭節(jié)活性的影響。

2.2他克林對細粒棘球蚴生發(fā)層細胞的體外作用效果 他克林對細粒棘球蚴生發(fā)層細胞活性的影響呈現(xiàn)劑量相關性(圖1B)，當其濃度為40 μg/mL時，對細胞活性的抑制率可達100%。而當他克林濃度降低至20 μg/mL時，細胞活性抑制率減少到(40.42±4.67)%。隨著藥物劑量的進一步降低，由他克林造成的生發(fā)層細胞活性抑制率低于20%。經(jīng)40 μg/mL的他克林作用后3 d后，細粒棘球蚴生發(fā)層細胞粘附于培養(yǎng)介質的基質消失，同時伴隨著非正常的細胞聚集以及細胞數(shù)目的減少(圖2D)。而在正常狀態(tài)下，生發(fā)層細胞經(jīng)過夜培養(yǎng)后貼壁生長，均勻平鋪于培養(yǎng)板(圖2C)。

注：A: 他克林對原頭節(jié)劑量反應關系曲線；B：他克林對生發(fā)層細胞劑量反應關系曲線。圖1 他克林對體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細胞活性的影響Fig.1 Activity of E. granulosus metacestodes and germinal cells treated with tacrine in vitro

注：A：DMSO對照組正常原頭節(jié)；B：他克林作用3 d原頭節(jié)；C：DMSO對照組正常生發(fā)層細胞；D：他克林作用3 d生發(fā)層細胞。圖2 體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細胞經(jīng)40 μg/mL的他克林作用后的形態(tài)變化Fig.2 Morphylogical changes of E. granulosus metacestodes and germinal cells caused by 40 μg/mL tacrine in vitro

2.3透射和掃描電子顯微鏡觀察結果 透射電鏡結果表明，DMSO對照組的原頭節(jié)形態(tài)正常，其體壁結構完整，包括遠端胞漿、肌肉束以及糖原儲存細胞等有序排列(圖3A)。而經(jīng)40 μg/mL的他克林作用3 d后，原頭節(jié)的超微結構發(fā)生了明顯的改變，主要體現(xiàn)在其體壁結構被破壞，出現(xiàn)了大量的空泡和脂肪滴(圖3B)。在掃描電鏡下觀察到DMSO對照組正常的生發(fā)層細胞為圓形，其形態(tài)均勻飽滿，通過粘附基質附著于培養(yǎng)板(圖3C)。當他克林作用3 d后，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化，主要表現(xiàn)在細胞出現(xiàn)塌陷或者萎縮，細胞粘附基質消失(圖3D)。

注：A：DMSO對照組正常原頭節(jié)；B：他克林作用3 d原頭節(jié)；C：DMSO對照組正常生發(fā)層細胞；D：他克林作用3 d生發(fā)層細胞。圖3 他克林(40 μg/mL)體外作用導致細粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細胞的超微結構變化Fig.3 Ultrastructural changes of Echinococcus granulosus metacestodes and germinal cells caused by 40 μg/mL tacrine in vitro

3 討 論

他克林作為乙酰膽堿酯酶抑制劑，于1994年由美國食品藥品管理局批準上市，用于治療輕到中度阿爾茲海默病[7]。本研究報道了他克林對棘球蚴的作用效果，實驗結果表明他克林對體外培養(yǎng)細粒棘球蚴生發(fā)層細胞和原頭節(jié)的活性均有直接影響，尤其是20 μg/mL和40 μg/mL的藥物濃度可造成大部分寄生蟲的死亡。藥物作用可引起原頭節(jié)超微結構的改變，在死亡的原頭節(jié)中可見大量的空泡和脂肪滴，該變化在其他藥物的作用中亦有報道[8-13]。根據(jù)此次實驗結果，發(fā)現(xiàn)細粒棘球蚴原頭節(jié)對于他克林相較于生發(fā)層細胞更為敏感，提示其主要通過影響原頭節(jié)的活性發(fā)揮抗包蟲作用效果，因此其不僅有作為抗包蟲藥物的潛能，亦可作為原頭節(jié)殺滅劑使用。

目前，治療包蟲病的藥物僅有甲苯達唑和阿苯達唑兩種，而上述藥物因為口服吸收較差，限制其藥效的進一步發(fā)揮。他克林作為臨床治療藥物，其系統(tǒng)的藥代動力學研究結果表明，其親脂性的特點使得口服他克林可被機體快速以及充分吸收[14-15]，可在腎臟、肝臟、膀胱等組織中檢測到較高的藥物濃度[16]，這些部位都是棘球蚴囊可能的寄生位點，提示其在經(jīng)口服給藥后可在棘球蚴治療靶位點達到有效藥物濃度，從而實現(xiàn)治療效果。根據(jù)本研究結果，他克林的對細粒棘球蚴原頭節(jié)的體外作用效果較好，但是需要較高藥物濃度才能對生發(fā)層細胞的活性有較強的抑制效果，因此在后續(xù)研究中應該重點關注他克林在治療包蟲病的給藥方案的優(yōu)化，尤其聯(lián)合用藥的可能性。據(jù)報道，在他克林治療阿爾茲海默病的臨床治療中，患者可出現(xiàn)轉氨酶的升高，但停藥后可恢復正常。鑒于包蟲病藥物治療的特點，通常需要長期給藥，因而他克林作為抗包蟲治療藥物的后續(xù)研究仍需考慮藥物毒性對治療帶來的影響。

他克林除了治療阿茲海默病，還對慢性腦缺血起到一定的保護作用[17]。其主要的作用機制為該藥物可通過抑制突觸間隙內乙酰膽堿的降解，從而活化及保護毒蕈堿和煙堿受體，以此改善患者的膽堿能系統(tǒng)功能，提高其認知能力[18]。另外，他克林可抑制K離子和Ca離子通道等一些電壓門控離子[19]。上述的乙酰膽堿酯酶以及離子通道等是否可作為他克林抗棘球蚴的藥物作用靶點還需進一步的研究加以證明。

綜上所述，本研究報道了他克林對細粒棘球蚴的作用效果，探索其作為治療包蟲病藥物新藥的應用前景。經(jīng)實驗驗證，他克林作用于體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴原頭節(jié)和生發(fā)層細胞，均表現(xiàn)出顯著的殺滅和抑制效果，提示其是潛在的包蟲病治療藥物。