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    金蓮花不同花部提取物的抗炎活性△

    2018-07-31 10:22:32李德利方明月王青青劉雙月賡迪王如峰馬超
    中國現(xiàn)代中藥 2018年7期
    關(guān)鍵詞:花部金蓮花花蕊

    李德利,方明月,王青青,劉雙月,賡迪,王如峰*,馬超

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,北京 102488;2.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

    金蓮花又名旱金蓮、旱荷、金梅草、金疙瘩等,是毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花,具有清熱解毒、消腫明目的功效[1-2]。近年臨床研究報告顯示,金蓮花在治療急性咽炎、風(fēng)熱感冒等方面療效顯著,已有多種劑型運(yùn)用于臨床,有報道稱金蓮花抗炎的作用甚至高于臨床常用的抗炎藥[3-4]。金蓮花化學(xué)成分明確,主要化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類和生物堿類。其中,黃酮類的含量最高,總黃酮約占金蓮花干重的16%[5-6],被認(rèn)為是金蓮花中最主要的活性物質(zhì)。

    本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn),金蓮花的不同花部,即花萼、花冠、花蕊群(雄蕊和雌蕊)、子房、花柄中的總黃酮含量存在差異[7];但是還不清楚它們的抗炎活性是否也有所不同,各花部的抗炎活性與其總黃酮含量是否存在相關(guān)性。為此,本文采用細(xì)菌脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型研究了金蓮花各花部提取物對一氧化氮(NO)分子釋放量的影響,并結(jié)合各花部提取物的總黃酮含量測定,對各花部提取物的抗炎活性與其總黃酮含量的相關(guān)性進(jìn)行了探討。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),METTLER AE240型1/10萬電子天平,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生物儀器廠),MC-18AIC(UV)CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司),SW-CJ-10潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),ECLIPSETE2000-S倒置熒光顯微鏡(Nikon公司),Epoch全自動酶標(biāo)儀(Bio Tek公司),30~300 μL八道移液器(Eppendorf公司),1000 μL/200 μL/20 μL單道移液器(Thermo公司)。

    1.2 藥品與試劑

    金蓮花購自河北安國藥材市場,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王如峰教授鑒定為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花。葒草素對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:YD0001502-171110);96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司);DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司);胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司);溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司);小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心);實驗試劑乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、磺胺、1-萘胺均為分析純。

    2 方法

    2.1 花部提取物的制備

    將金蓮花按各花部(花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄)分離,取材如圖1所示。稱取各花部10 g,95%乙醇超聲提取2次,第一次30倍量乙醇提取30 min,第二次40倍量乙醇提取30 min,合并兩次提取液,四層紗布過濾,常溫下減壓濃縮,揮干至恒重,即得金蓮花各花部提取物,各花部提取率為提取物質(zhì)量/花部質(zhì)量[8]。

    圖1 金蓮花花部模式圖

    2.2 花部提取物總黃酮含量測定

    2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取葒草素對照品20.0 mg,置于50 mL容量瓶中,加適量95%乙醇,50 ℃水浴加熱溶解,放冷,用95%乙醇稀釋至刻度。精密量取25 mL于50 mL量瓶中,用95%乙醇稀釋至刻度,即得對照品溶液。其中葒草素的質(zhì)量濃度為200 mg·L-1。

    2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取對照品溶液0、1、3、5、7、9、11 mL,分別置于25 mL量瓶中,加95%乙醇至11 mL,搖勻;然后,分別加入5% NaNO2溶液1 mL,搖勻;放置6 min后,加入10% Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻;再放置6 min后,加入4% NaOH 溶液10 mL;最后,用95%乙醇稀釋至體積,搖勻。放置15 min后,以第一管作為空白對照,用比色法在510 nm處測定吸光度,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、吸光度為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出回歸方程[8]。

    2.2.3 總黃酮含量測定 稱取各花部醇提取物20 mg,于1 mL 95%乙醇中完全溶解,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,量取0.5 mL于25 mL容量瓶中。同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法,測定510 nm處吸光度(A)值,由線性回歸方程計算各花部提取物總黃酮質(zhì)量濃度。依公式(1)計算各花部提取物總黃酮含量(W)。各花部生藥總黃酮含量為提取物總黃酮含量×提取率。

    (1)

    式中:C為質(zhì)量濃度,V為測定體積,N為稀釋倍數(shù),M為總提取物質(zhì)量,m為測定質(zhì)量。

    2.3 抗炎活性實驗

    2.3.1 最大無毒濃度 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,制成密度為1.5×105個·mL-1的細(xì)胞懸液,接種于96孔板中培養(yǎng),每孔100 μL。培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后,棄去舊的培養(yǎng)液,依次加100 μL含藥培養(yǎng)液(80、160、320、640 μg·mL-1各花部提取物和25、50、100、200、400 μmol·L-1阿司匹林),空白對照組加等量含有PBS的培養(yǎng)液,每組設(shè)4個平行孔。藥物作用于細(xì)胞20 h后,棄去含藥培養(yǎng)液,每孔加入質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的MTT溶液100 μL,混勻。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀測定每孔的吸光度(A)值,檢測波長為490 nm。根據(jù)測得的A值計算細(xì)胞存活率。

    2.3.2 抗炎實驗 通過構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型,Griess試劑法測定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO釋放量,能直觀反映炎癥的發(fā)生,因此以評價NO分子的分泌量來篩選抗炎藥物是一種普遍運(yùn)用且簡單可行的方法[9-10]。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,制成密度為1.5×105個·mL-1的細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,每孔100 μL,培養(yǎng)12 h,待細(xì)胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)液。加入新鮮的含藥和LPS的培養(yǎng)基120 μL,其中LPS質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1。設(shè)空白對照組、陰性對照組、陽性對照組(阿司匹林 25、50、100、200、400 μmol·L-1)和不同劑量加藥組(16、32、64 μg·mL-1各花部提取物),培養(yǎng)20 h后吸取上清液,加入Griess試劑A液(1%磺胺),混合均勻后37 ℃孵育10 min,再加入Griess 試劑B液(0.1%N-1-萘乙二胺鹽酸鹽),混合均勻后37 ℃孵育10 min。在自動酶標(biāo)儀上測定540 nm下的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.001 8X+0.049 9(r=0.999 8)求出各組的NO濃度,按公式(2)計算NO抑制率。

    (2)

    式中:CLPS組為LPS組NO質(zhì)量濃度,C實驗組為實驗組NO質(zhì)量濃度。

    2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    3 結(jié)果

    3.1 花部提取物總黃酮含量

    以已知濃度的葒草素為對照,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=0.003 6X+0.044 3(r=0.999 7),表示對照品在8~88 μg·mL-1線性關(guān)系良好。金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄中均含黃酮類成分,但各花部提取物之間的總黃酮含量存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。各花部提取物中總黃酮含量順序為:花柄>花萼>花冠>子房>花蕊群;結(jié)合各花部的提取率,計算各花部生藥的總黃酮含量順序為花萼>花柄>花冠>子房>花蕊群。具體含量見表1。

    表1 金蓮花各花部及提取物中總黃酮含量

    注:各花部提取物及花部之間比較,**P<0.01。

    3.2 花部抗炎活性

    3.2.1 最大無毒濃度 采用MTT法測定了不同質(zhì)量濃度的金蓮花5個花部提取物及陽性藥阿司匹林對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響,結(jié)果如圖2所示。金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、花柄4個花部提取物質(zhì)量濃度在80~640 μg·mL-1時,子房提取物質(zhì)量濃度在80~320 μg·mL-1時細(xì)胞存活率與陰性對照組無統(tǒng)計學(xué)差異,表明在此質(zhì)量濃度下,各花部提取物對RAW264.7細(xì)胞的正常生長無毒性影響。陽性對照組阿司匹林在實驗濃度(25、50、100、200、400 μmol·L-1)下對RAW264.7細(xì)胞無細(xì)胞毒作用。

    注:**P<0.01表示該提取物質(zhì)量濃度下具有細(xì)胞毒性。圖2 各花部提取物對RAW264.7細(xì)胞存活率的影響

    3.2.2 抗炎活性結(jié)果 LPS組與空白對照組相比,NO釋放量明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);陽性藥阿司匹林對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量具有明顯的抑制作用,其NO釋放量比LPS組明顯減少,且各濃度均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01),如圖3所示,表示LPS能誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生,該細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功。

    注:與LPS組相比,**P<0.01。圖3 阿司匹林對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

    利用上述構(gòu)建的細(xì)胞模型,用Griess試劑法測定了金蓮花5個花部提取物在16~64 μg·mL-1對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO分子的釋放量。與LPS組相比,花蕊群和子房兩個部位在實驗濃度下對NO釋放量有顯著性抑制作用(P<0.01),花萼和花柄濃度在32~64 μg·mL-1時,抑制作用明顯(P<0.01),花萼在16 μg·mL-1時抑制作用較弱(P<0.05),而花冠只在最高濃度即64 μg·mL-1時表現(xiàn)出抑制作用(P<0.05),如圖4所示。由抑制率公式計算NO抑制率,結(jié)果如表2所示,相同質(zhì)量濃度下花蕊群和子房提取物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的抑制率比其他花部高,且二者的抑制率之間無差異。其次是花萼和花柄提取物,二者對NO釋放抑制作用的效果相當(dāng),均高于花冠提取物。

    注:與LPS組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖4 各花部提取物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響

    表2 各花部提取物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放的抑制率

    注:和花蕊群比較,#P<0.05,##P<0.01;和子房比較,△P<0.05,△△P<0.01;和花萼比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

    3.3 各花部提取物抗炎活性與其總黃酮含量的相關(guān)性

    金蓮花各花部的提取物具有良好的抗炎活性,為直觀反映提取物抗炎活性與其總黃酮含量之間的關(guān)系,根據(jù)3.1項下結(jié)果,計算實驗條件下(16、32、64 μg·mL-1,加藥體積100 μL)各花部提取物中的總黃酮含量,其與NO分子釋放抑制率對應(yīng)關(guān)系如圖5所示。在本實驗濃度范圍內(nèi),各花部提取物對NO分子釋放的抑制率與各自總黃酮含量之間存在劑量依賴性;即同一花部,提取物總黃酮含量越高,對NO分子釋放的抑制作用越強(qiáng);但從不同花部之間比較來看,各花部提取物對NO分子的抑制率與總黃酮含量之間無明顯關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)r=-0.035 71,P>0.05)。如子房和花蕊群兩個花部提取物中的總黃酮含量較其他花部少,抑制率卻最高;花萼和花柄部位提取物的總黃酮含量最高,但對NO分子釋放的抑制效果并不是最好。

    圖5 花部提取物總黃酮含量與NO釋放抑制率的關(guān)系

    4 討論

    金蓮花各花部提取物及花部之間的總黃酮含量存在顯著差異,即花部之間:花萼>花柄>子房>花蕊群>花冠,與文獻(xiàn)報道一致[7];提取物中:花柄>花萼>花冠>子房>花蕊群。為進(jìn)一步明確各花部提取物中總黃酮含量和抗炎活性之間的關(guān)系,借助LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型,研究了相同質(zhì)量濃度下不同花部提取物對細(xì)胞NO分子釋放量的影響。NO分子在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色,參與致炎因子的分布和損傷等病理過程。通常炎癥發(fā)生時,NO分子的釋放量明顯增加[11-12]。本文通過計算各花部提取物對NO分子的抑制率來表征各花部提取物的抗炎作用,結(jié)果表明金蓮花的花萼、花冠、花蕊群、子房、花柄提取物均能抑制NO分子的產(chǎn)生,表現(xiàn)出一定程度的抗炎作用,且子房和花蕊群>花萼和花柄>花冠提取物。結(jié)合各花部提取物中的總黃酮含量測定結(jié)果,表明金蓮花不同花部抗炎活性的強(qiáng)弱與各花部提取物中總黃酮的含量不成正比,提示黃酮類成分并不是金蓮花抗炎活性的唯一藥效物質(zhì)。本課題組前期關(guān)于金蓮花各花部的指紋圖譜研究[13]也表明,雖然子房和花蕊群與其他花部的指紋圖譜相似,但是其主要黃酮類成分的含量卻低于其他花部。因此,除了黃酮類之外,金蓮花的抗炎活性成分還應(yīng)包含酚酸類和生物堿類等其他結(jié)構(gòu)類型。

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