樣品不同處理方法提取甜菜基因組DNA的比對(duì)研究

鄒奕 ，興旺 ，2，3，朱尚明 ，栗媛 ，齊少瑋 ，吳則東 ，2，3*

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

甜菜基因組DNA提取的方法很多，如常用的CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法就是利用CTAB將細(xì)胞膜溶解，并與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽濃度下溶解于液相中，而在低鹽的溶液中則會(huì)沉淀，CTAB緩沖液中含有高濃度的NaCl，用于提供高鹽濃度，同時(shí)含有EDTA，用于抑制DNase活性，使用酚、氯仿和異戊醇對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性抽提，最后用乙醇或者異丙醇對(duì)DNA進(jìn)行沉淀；其它的提取方法還有SDS（十二烷基磺酸鈉）法、蛋白酶K法、使用試劑盒以及堿裂解法等等。如臘萍等[1]分別采用CTAB法和SDS法提取甜菜基因組DNA，結(jié)果表明，改進(jìn)的CTAB法提取的DNA純度好，產(chǎn)率高；沙紅等[2]也對(duì)CTAB法和SDS法提取甜菜基因組DNA進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果也表明CTAB法提取的DNA純度要好于SDS法；吳則東等[3]利用堿裂解法提取甜菜基因組DNA，該方法提取DNA只需要一種藥劑，提取方便且時(shí)間短，提取的DNA可以用于SSR引物擴(kuò)增，但由于沒(méi)有經(jīng)過(guò)提純，故雜質(zhì)較高。在甜菜基因組DNA的提取過(guò)程中，取樣一般以葉片[4]、花蕾[5]、種子[6]、幼嫩花序及塊根[7]為材料進(jìn)行基因組DNA的提取。

決定DNA的效率以及純度很重要的一個(gè)因素是關(guān)于樣品的處理，利用鮮樣提取DNA，要想保證提取DNA的純度，就一定要避免樣品的降解，以往在處理樣品時(shí)，大都利用液氮在研缽中進(jìn)行研磨或者利用研磨杵在離心管中將樣品研磨成粉末，研缽研磨樣品后在轉(zhuǎn)移到離心管中時(shí)容易造成樣品損失，而且一般都是鮮樣直接處理，而研磨杵在研磨時(shí)由于操作的角度較小，容易造成部分樣品無(wú)法研磨成粉末。本文將探討如何通過(guò)處理樣品較快速地提取甜菜基因組DNA，并驗(yàn)證提取的DNA濃度及純度。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中用到的12個(gè)甜菜品系均來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，樣品編號(hào)分別為1～12。

每份甜菜種子取10粒，用紗布包好后放到蒸餾水中浸泡24h，將蛭石放到搪瓷盤里，用自來(lái)水浸泡后，將水空出，然后放到烘箱中進(jìn)行烘干，180℃，大約4h，待蛭石烘干后，取出，溫度降到室溫后，將蛭石裝入到營(yíng)養(yǎng)缽中，留3cm左右的高度，營(yíng)養(yǎng)缽中加蒸餾水至水從營(yíng)養(yǎng)缽下面剛好流出，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽播種10粒浸泡好的種子，上面覆蓋好消毒的蛭石。待兩片子葉展平后，每份種子取5株用于提取基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 甜菜DNA提取方法 處理1：取1～6號(hào)編號(hào)的樣品，每個(gè)樣品取3株，用錫箔紙包好，然后將包好樣品的錫箔紙放入到預(yù)先裝好液氮的小罐中，等到液氮不再發(fā)出吱吱聲時(shí)，用鑷子夾出錫箔紙，然后用研磨棒快速研磨錫箔紙，將樣品研磨成粉末，倒入2mL的離心管中，然后向離心管中加入800μL的CTAB緩沖液，65℃干浴1h，期間上下?lián)u動(dòng)幾次，使CTAB充分浸入到樣品中去；將樣品冷卻至室溫，加入400μL的24∶1的氯仿/異戊醇，上下混勻；12000 r/min離心10min，取上清液加入到2mL的離心管中，然后加入等體積的異丙醇，上下?lián)u動(dòng)后放入到冰箱冷凍層10min，之后12000 r/min離心10min，棄掉上清液；利用干浴鍋將異丙醇揮發(fā)干凈，加入100μL的TE溶解DNA。

處理2：取7～12號(hào)編號(hào)的樣品，每個(gè)樣品取3株放入到預(yù)裝有800μL CTAB緩沖液的2mL離心管中，每個(gè)離心管中放入兩粒鋼珠，直接利用研磨機(jī)進(jìn)行打磨，反復(fù)震蕩幾次，待樣品打碎后，將鋼珠倒出，把離心管放入到干浴鍋中，之后步驟同處理1。

1.2.2 甜菜基因組DNA的檢測(cè) 分別利用微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和純度。微量分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)只需要滴入2μL的DNA原液進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖檢測(cè)時(shí)加入5μL的DNA原液和1μL的6×染料，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行照相記錄。1.2.3 SSR檢測(cè) 將提取的DNA均稀釋到10ng/μL，利用SSR引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，體系和程序見(jiàn)文獻(xiàn)[8]，PCR產(chǎn)物的檢測(cè)利用快速銀染法[9]。

2 結(jié)果與分析

表1 樣品不同處理方法提取的DNA濃度

2.1 利用微量分光光度計(jì)檢測(cè)

利用微量分光光度計(jì)對(duì)提取DNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)（表1），兩種處理方法提取的DNA濃度相差不大，說(shuō)明兩種處理樣品的方法均能夠提取出濃度較高的DNA。

2.2 瓊脂糖檢測(cè)提取DNA的純度

利用1%的瓊脂糖凝膠對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1，編號(hào)1～6對(duì)應(yīng)處理1，編號(hào)7～12對(duì)應(yīng)處理2，從圖1中可以看出，處理1條帶清晰完整，沒(méi)有虛帶，說(shuō)明提取的DNA純度非常好，而處理2均有部分虛帶，可能是由于震蕩過(guò)程中造成個(gè)別DNA條帶斷裂所致。

2.3 利用PCR對(duì)提取的甜菜基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增

利用甜菜SSR引物FDSB1023對(duì)12個(gè)品系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行檢測(cè)，從圖2擴(kuò)增結(jié)果可以看出，兩種處理樣品的方法均能對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增。說(shuō)明兩種提取方法均可用于甜菜SSR引物的擴(kuò)增。

圖1 1%瓊脂糖凝膠對(duì)甜菜品系提取的DNA檢測(cè)結(jié)果1～12甜菜品系編號(hào)

圖2 引物FDSB1023對(duì)甜菜品系的聚丙烯酰胺檢測(cè)結(jié)果1～12為甜菜品系編號(hào)

3 結(jié)論

影響基因組DNA提取效率和效果的一個(gè)主要因素就是對(duì)樣品的處理，樣品研磨的越精細(xì)，提取DNA的效果越好，同時(shí)對(duì)于冷凍的樣品又害怕反復(fù)的凍融，這樣DNA就很容易降解。本文給出了一個(gè)比較好的解決方案，如果實(shí)驗(yàn)室有研磨機(jī)，就可以將要提取DNA的鮮樣直接放到2mL的離心管中，同時(shí)在離心管中放入兩顆鋼珠或者鋯珠，如果馬上就提取DNA，可以在離心管中直接加入CTAB緩沖液，之后利用研磨機(jī)直接將樣品打碎，進(jìn)行提取，如果需要以后再進(jìn)行提取，就可以將加有鋼珠和樣品的離心管放到-80℃的冰箱中進(jìn)行保存，等到需要提取時(shí)再加入緩沖液進(jìn)行打磨提取，這種提取方法一次就可以處理24個(gè)樣品，處理的速度很快；對(duì)于沒(méi)有研磨機(jī)的實(shí)驗(yàn)室，可以在取樣的時(shí)候直接利用錫箔紙將植物鮮樣包好，用記號(hào)筆記上編號(hào)，如果不是近期進(jìn)行DNA的提取，就把樣品放到-80℃的冰箱中進(jìn)行保存，在需要提取時(shí)，取出直接放到裝有液氮的保溫瓶中冷凍，之后利用研磨棒進(jìn)行研磨，提取DNA。