分子標(biāo)記在稻瘟病研究中的應(yīng)用

歐陽偉

摘 要 稻瘟病屬于水稻種植中一種常見的病害，給水稻產(chǎn)量和質(zhì)量造成了較多的不利影響，因此，需要科研人員從分析生物學(xué)角度出發(fā)，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)發(fā)生稻瘟病水稻的抗瘟基因進(jìn)行研究，借助于該種基因研制可以有效抵御稻瘟病的水稻品種，以此控制稻瘟病的發(fā)病率，實(shí)現(xiàn)水稻生產(chǎn)數(shù)量和品質(zhì)的提高?；诖?，對(duì)當(dāng)前稻瘟病的發(fā)病原因、抗病基因的研究情況進(jìn)行了概述，結(jié)合研究成果分析了分子標(biāo)記的定義，種類，重點(diǎn)介紹了分子標(biāo)記在稻瘟病研究中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 稻瘟病；分子標(biāo)記；基因；染色體；抗病

中圖分類號(hào)：S435.111 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.12.096

水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的一種糧食作物，世界上有超過1/3的人口以水稻為主糧。在我國，有65%的人口也是以水稻為主要口糧[1]。由病原菌Magnaporthe grisea引起的稻瘟病是水稻最重要的病害之一，俗稱水稻癌癥。該病害嚴(yán)重制約水稻生產(chǎn)，在稻瘟病大爆發(fā)年份，發(fā)病重的區(qū)域可造成水稻減產(chǎn)，減產(chǎn)幅度可以達(dá)到40%～50%，甚至絕產(chǎn)[2]，而且會(huì)影響稻米品質(zhì)。

在水稻生產(chǎn)過程中，為了減少稻瘟病病害對(duì)于水稻的影響，常采用種植優(yōu)質(zhì)水稻品種、化學(xué)農(nóng)藥法等手段進(jìn)行防治，但由于藥物使用量不合理、水稻種植環(huán)境惡化，導(dǎo)致稻瘟病變異速度較快，應(yīng)用常規(guī)防治方法干預(yù)病菌效果不理想，水稻抗病菌能力嚴(yán)重下降，而且過量使用農(nóng)藥易導(dǎo)致環(huán)境污染問題[3]。根據(jù)目前的研究可知，抗病品種是防治稻瘟病最好的辦法。鑒定和發(fā)掘更多的抗瘟基因，并對(duì)之進(jìn)一步定位克隆，通過多基因聚合，獲得持久的抗病品種，是現(xiàn)代育種家最直接的育種目標(biāo)。

1 稻瘟病的研究現(xiàn)狀

1.1 稻瘟病抗性基因的定位與克隆

20世紀(jì)80年代，日本學(xué)者Kiyasawa等用經(jīng)典遺傳學(xué)的方法鑒定出8個(gè)位點(diǎn)上的14個(gè)主效顯性抗稻瘟病基因，包括Pik位點(diǎn)的Piks、Pikp、Pikh、Pikm和Pik，Pita位點(diǎn)的Pita和Pita2，Piz位點(diǎn)的Piz和Piz1，以及Pii、Pia、Pish、Pib和Pit等。隨著分子標(biāo)記水平的不斷發(fā)展，稻瘟病抗性基因的定位及復(fù)制得到了較快發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)有87個(gè)抗稻瘟病基因，87個(gè)基因分布在除第3染色體上的其他11條染色體上，并有成簇分布的趨勢(shì)。其中，最大的3個(gè)基因簇分別位于水稻的第6、11、12染色體上。如第6染色體上已定位了14個(gè)抗性基因，第11染色體上定位了24個(gè)抗性基因，第12染色體上則已定位16個(gè)抗性基因。

1.2 稻瘟病產(chǎn)生的原因

稻孢菌（Pyricularia oryae）屬于半知菌亞門，為水稻稻瘟病的主要病原菌。水稻感染稻孢菌后，會(huì)在水稻中進(jìn)行分生孢子、附著孢、侵染性菌絲的產(chǎn)生與分裂等一系列的變化。其具體過程是：稻孢菌以菌絲體和分生孢子的形式在稻草和稻谷上越冬，當(dāng)?shù)诙隁鉁鼗厣?0 ℃左右時(shí)候，遇降雨就會(huì)萌發(fā)累積分生孢子。孢子的萌發(fā)主要集中在在夜間12點(diǎn)至第二天早上6點(diǎn)。接觸到禾苗后，在合適的溫度、濕度下就會(huì)侵染禾苗，使禾苗產(chǎn)生病害。

2 分子標(biāo)記在稻瘟病研究中的應(yīng)用

2.1 分子標(biāo)記概述

該種技術(shù)包括細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、分子標(biāo)記、形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記等遺傳標(biāo)記形式，其中分子標(biāo)記較其他方法優(yōu)點(diǎn)較多：1）核酸，不局限于基因是否表達(dá)，不需要分析組織或器官特異性，不受季節(jié)環(huán)境的限制；2）遍及全部基因組，數(shù)量豐富，標(biāo)記的數(shù)量不受限制；3）自然存在大量的等位變異，高多態(tài)性；4）共顯性多，很容易鑒別出基因型與雜合基因性；5）檢測(cè)手段方便快捷，良好的重復(fù)性；6）不影響目標(biāo)形狀的表達(dá)，不關(guān)聯(lián)不良形狀。

2.2 分子標(biāo)記的不同類型

分子標(biāo)記包含的多態(tài)性標(biāo)志類型較多，主要有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性、簡單重復(fù)序列、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性、長度片段多態(tài)性、染色體或基因組原位雜交（GISH），mRNA差別顯示（mRNA DD），代表性差異分析法（RDA），任意引物PCR（AP-PCR），單引物擴(kuò)增反映（SPARs）等。

2.2.1 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)（RAPD）

該技術(shù)使用時(shí)可以在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）作用下，對(duì)物質(zhì)基因組的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，最終獲得PCR產(chǎn)物。該產(chǎn)物在生成過程中，DNA片段應(yīng)用隨機(jī)引物來擴(kuò)增，之后與模板結(jié)合方向互補(bǔ)存在，保證結(jié)合位點(diǎn)具有較短的結(jié)合位置。RAPD技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1）無須獲得序列信息即可進(jìn)行DNA片段的大量擴(kuò)增；2）技術(shù)操作較為簡單，采集樣本數(shù)量少，技術(shù)應(yīng)用成本支出較少；3）樣本遺傳基因?yàn)轱@性。但是，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行處理，易導(dǎo)致樣本中的純合子、雜合子無法被鑒別出來，堿基大小相同但是序列不同的片段，不能分開進(jìn)行處理。

2.2.2 簡單重復(fù)序列（SSRs）

技術(shù)類型主要有（AC）n、（GA）n等，處于兩端的序列為單拷貝，在PCR下對(duì)隨機(jī)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，在多次重復(fù)后，片段長度有著極大差異。技術(shù)在應(yīng)用時(shí)，操作難度較低，便于工作人員直接操作，樣本多態(tài)檢驗(yàn)結(jié)果較為精確。水稻中含有數(shù)量龐大的簡單重復(fù)序列，因此該技術(shù)的應(yīng)用效果較好。在現(xiàn)階段的研究中，Mccouch等人選擇樣本，進(jìn)行了簡單重復(fù)序列引物的開發(fā)，樣本引物數(shù)量共計(jì)為2 414對(duì)，標(biāo)記點(diǎn)位2 240個(gè)，經(jīng)過技術(shù)應(yīng)用樣本標(biāo)記數(shù)量有2 740個(gè)，之后再對(duì)樣本進(jìn)行遺傳多樣性、基因定位等分析可知有著良好的應(yīng)用價(jià)值。

2.2.3 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLPs）與長度片段多態(tài)性（RFLPs）

長度片段多態(tài)性屬于分子標(biāo)記技術(shù)中最先被研究出的一種多態(tài)性標(biāo)記形式，在遺傳連鎖領(lǐng)域中應(yīng)用較多。技術(shù)應(yīng)用時(shí)，可以直接破壞限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，使得酶切片段可以在同一區(qū)域生成。應(yīng)用特異性探針可以對(duì)存在差異的片段帶型進(jìn)行檢測(cè)，遺傳片段以顯性遺傳形式來表示，不具有表型效應(yīng)，標(biāo)記點(diǎn)在不同等位時(shí)，不會(huì)發(fā)生互相干擾情況。但此法應(yīng)用的成本高，樣本采集數(shù)量多，檢測(cè)技術(shù)操作復(fù)雜，長時(shí)間進(jìn)行同位素檢測(cè)，易對(duì)工作人員造成人身損害。因此可以在該技術(shù)應(yīng)用基礎(chǔ)上，聯(lián)合AFLPs技術(shù)來檢測(cè)。

2.2.4 酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS）

技術(shù)原理為對(duì)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，待位點(diǎn)出現(xiàn)喪失、重新生成時(shí)，需要使用引物重新設(shè)計(jì)位點(diǎn)。具體流程：DNA片段經(jīng)PCR實(shí)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)的擴(kuò)增，產(chǎn)生的產(chǎn)物應(yīng)用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消解處理，酶切片段的大小應(yīng)用電泳法來確定，該法多用來對(duì)樣本的基因型信息進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.5 候選基因技術(shù)（同源序列）（RGA）

對(duì)植物的抗病基因進(jìn)行克隆，獲得的產(chǎn)物中有蛋白激酶、核苷酸結(jié)合位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)域，用于識(shí)別細(xì)胞信號(hào)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，并對(duì)上述物質(zhì)進(jìn)行傳導(dǎo)處理。在抗病基因克隆基礎(chǔ)上對(duì)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，得到的片段序列非常相似?？蒲腥藛T在對(duì)馬鈴薯的抗病基因產(chǎn)物的研究中，在原來基因上利用引物合成了RGA片段。

2.3 分子標(biāo)記在稻瘟病研究中的應(yīng)用

稻瘟病的研究中，使用分子標(biāo)記技術(shù)可以促使水稻充分發(fā)揮出抗病作用，有助于研究人員對(duì)抗病基因進(jìn)行克隆處理。在抗病基因以往的研究中，長度片段多態(tài)性利用率高，但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，由于該技術(shù)存在檢驗(yàn)操作難、結(jié)果得出時(shí)間長、檢驗(yàn)費(fèi)用和樣本數(shù)量多、適用范圍少等弊端，逐漸被簡單重復(fù)序列等技術(shù)所取代，極大地提高了抗病基因研究的效率和質(zhì)量，對(duì)于人體不會(huì)造成嚴(yán)重傷害，安全性高，在目前的植物疾病基因定位研究中應(yīng)用廣泛。

2.4 在水稻抗病基因育種中應(yīng)用分析標(biāo)記技術(shù)

為了提高水稻的種植質(zhì)量，減少稻瘟病大面積暴發(fā)給農(nóng)戶造成的經(jīng)濟(jì)損失，需要不斷推廣與應(yīng)用預(yù)防稻瘟病的水稻新品種培育方法。以往在品種培育時(shí)，多選擇目標(biāo)性狀直接進(jìn)行培育，獲得的水稻品種種植效果好，但品種培育數(shù)量較少，培育時(shí)間較長，該法的應(yīng)用效果不理想。因此水稻種植人員在育種時(shí)，可以學(xué)習(xí)分子生物的相關(guān)知識(shí)，了解分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品、植物培育時(shí)發(fā)揮的重要作用，依托該技術(shù)進(jìn)行抗稻瘟病水稻的育種工作。在水稻育種中，使用該技術(shù)手段可以選擇水稻的隱性性狀，在作物生長期間可以在各個(gè)階段對(duì)DNA片段進(jìn)行檢驗(yàn)，分析片段是否發(fā)生變異以及變異的程度，是否有利于多基因聚合水稻的育種。該技術(shù)育種時(shí)的應(yīng)用價(jià)值高，對(duì)于育種的操作要求較低，樣本數(shù)量要求不多，成本可以得到有效控制，培育出的水稻新品種對(duì)于生長環(huán)境有著良好的適應(yīng)性。因此分子標(biāo)記技術(shù)需要在水稻抗病育種中大量應(yīng)用，以此促進(jìn)諸多水稻種植農(nóng)戶經(jīng)濟(jì)收益的提升。

3 展望

當(dāng)今科技日益發(fā)展，特別是生物信息學(xué)領(lǐng)域更是迅猛發(fā)展。分子標(biāo)記技術(shù)雖然開發(fā)的時(shí)間不長，但應(yīng)用范圍極廣。分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用最重要的限制因子是成本和利益，雖然從表面來看，分子標(biāo)記花費(fèi)的成本較傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)標(biāo)記高，但隨著分子標(biāo)記在遺傳學(xué)的廣泛應(yīng)用，各種標(biāo)記分析技術(shù)已程序化而易于實(shí)施。分子生物學(xué)理論和技術(shù)的快速發(fā)展，必將不斷開發(fā)出成本低、信息量大、應(yīng)用范圍廣的分子標(biāo)記技術(shù)。在稻瘟病研究領(lǐng)域，應(yīng)用分子標(biāo)記來定位抗性基因已經(jīng)取得了顯著成績。但也存在一些不足，如稻瘟病抗性基因的定位群體與育種群體存在脫節(jié)，基因定位的成果難于直接應(yīng)用到育種研究上。在以后的研究中應(yīng)該加強(qiáng)：1）在稻瘟病定位研究中選用育種材料來構(gòu)建定位群體，縮短基礎(chǔ)研究與應(yīng)用研究的距離；2）開發(fā)更多實(shí)用簡單易操作的分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)一步促進(jìn)分子標(biāo)記輔助育種在實(shí)踐中的應(yīng)用和推廣。

參考文獻(xiàn)：

[1] 康美花，曹豐生，陳紅萍，等.水稻稻瘟病抗性基因研究進(jìn)展及其在育種上的應(yīng)用[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（2）：95-98.

[2] 崔永，劉自旭.水稻稻瘟病抗性基因的研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（12）：40-43.

[3] 李楊，王耀雯，王育榮，等.水稻稻瘟病菌研究進(jìn)展[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（8）：789-792.

（責(zé)任編輯：趙中正）