慢性壓迫性頸脊髓病山羊模型的建立與評估

沈寶良，李云飛，韓擎天，高生，沈洪興，2，殷勇*

(1上海健康醫(yī)學院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院，上海 201800；2上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院，上海 200127)

慢性壓迫性頸脊髓病(chronic spinal cord disease，CSCD)是由于年齡增長，頸部骨質(zhì)增生、骨贅形成、椎間盤退化突出、后縱韌帶骨化、黃韌帶增生肥厚等多種原因造成的頸部脊髓長期受壓所產(chǎn)生的一系列臨床癥狀和體征[1-3]。建立科學有效的動物實驗模型，可以彌補該病在臨床工作中病理機制研究的不足。近年來對慢性壓迫性頸脊髓動物模型的研究對象主要集中在嚙齒類動物，大型動物的研究較少[4-6]。本實驗以山羊為模型動物，采用一種新型的脊髓壓迫系統(tǒng)建立了慢性壓迫性頸脊髓動物模型，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與分組 10～12月齡的雌性崇明山羊12只(上海寶山區(qū)羅涇錫華實驗動物養(yǎng)殖場)，體重30～40 kg，隨機分為實驗組(9只)和對照組(3只)。實驗組9只山羊在模型建立后的第4周、8周和12周時各處死2只，進行病理檢測分析。

1.2 球囊壓迫裝置制作 取1根醫(yī)用兒童導尿管(8號)，將其前端固定在1枚醫(yī)用的聚乙烯螺釘內(nèi)，導尿管與螺釘間的縫隙用硅膠充填，實驗前檢測無滲漏方可使用。螺釘規(guī)格：外側徑10 mm，內(nèi)側徑8 mm，以上各部分組成實驗用的慢性球囊壓迫裝置(見圖1)。

a 未充盈前 b 充盈后

圖1 慢性球囊壓迫裝置

圖2 術中顯露C3水平硬膜囊

1.3 動物模型制作 造模手術前12 h，實驗動物禁食、水，手術區(qū)域備皮，用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)進行靜脈麻醉，氣管插管后將實驗動物仰臥固定于手術臺上，頸后墊高固定，保持頸部中立。術前X線片透視定位，確定C3椎體，行頸前旁正中切口，逐層切開皮膚和皮下組織，分離保護頸動脈和氣管，暴露C3椎體及上下椎間隙。將定位針置于C3椎體再次透視確定無誤后，于C3椎體前正中用空心環(huán)鉆鉆出一直徑約8 mm的骨隧道，再用直徑10 mm的絲攻擴大骨隧道，暴露硬膜囊(見圖2)。測深器確定骨隧道深度，將相同尺寸的聚乙烯螺釘球囊裝置慢慢擰入，確定螺釘無松動后逐層縫合切口，導尿管體部用絲線固定于皮膚上。術后每7天經(jīng)外置導尿管向球囊注射碘海醇造影劑0.1 mL，直至12周。對照組同實驗組一樣安裝好球囊壓迫裝置，但術后不注射造影劑，每7天記錄一次實驗數(shù)據(jù)。

1.4 脊髓運動功能評分 術后采用Tarlov評分[7]進行實驗動物脊髓運動功能評分，5分：正常，可跳可跑；4分：能跑但不能跳；3分：能走但不能跑；2分：可站立，但不能走；1分：不能站立但肢體可以活動；0分：肢體完全癱瘓。

1.5 影像學評估 術后第4、8、12周行頸椎X線、CT檢查。術后X線片示球囊內(nèi)造影劑滲漏至椎管內(nèi)的實驗動物予以廢棄，同時補充相同量新的實驗動物。

1.6 病理學檢測 對照組在實驗結束后處死，實驗組在建模后第4、8、12周時各處死2只，取下實驗動物C3椎體節(jié)段上下約3 cm的脊髓組織，常規(guī)石蠟切片，行HE染色，并在光鏡下觀察病理學變化。

2 結 果

2.1 脊髓運動功能評分結果 本實驗中無實驗動物出現(xiàn)意外死亡情況。對照組在各觀察時間點脊髓運動功能均正常。實驗組在建模術后第4周，所有動物脊髓運動功能均正常(Tarlov評分均為5分)；術后5、7、8周時，分別有1只不能跳躍，但能跑動(Tarlov評分均為4分)；術后第10周時，有2只動物出現(xiàn)不能跑，但可以走動(Tarlov評分分別為3分)，術后第11周時，又有1只動物出現(xiàn)不能跑動，但可以走(Tarlov評分分別為3分)，術后第12周時，有2只動物出現(xiàn)不能走動，但可以站立(Tarlov評分分別為2分)，實驗結束，沒有動物出現(xiàn)肢體完全癱瘓。

2.2 影像學檢查結果 術后第4、8、12周分別行X線、CT檢查。影像學結果顯示：對照組脊髓未見明顯壓迫；實驗組慢性球囊壓迫裝置穩(wěn)定，未見松動，球囊膨脹直徑從第1周1.0 mm逐漸增大至第12周5.8～6.4 mm(平均直徑6.1 mm)，隨著造影劑不斷注入，實驗動物脊髓呈現(xiàn)逐漸受壓態(tài)勢。術后12周最后一次注射時，X線透視可見實驗動物頸椎椎體序列良好，慢性球囊壓迫系統(tǒng)裝置固定確切(見圖3)；CT示球囊向椎管內(nèi)腹側壓迫(見圖4)。

2.3 病理學結果 H-E染色可見：對照組神經(jīng)元細胞、軸突和白質(zhì)正常(見圖5a、5b)；實驗組術后4周時病理學結果與對照組相同，未見明顯改變；但術后第8周時，顯微鏡下見受壓節(jié)段脊髓前角內(nèi)神經(jīng)元細胞變性，胞體出現(xiàn)萎縮變小，但數(shù)量未見明顯減少，部分白質(zhì)出現(xiàn)輕度脫髓鞘改變，部分軸突出現(xiàn)空泡樣變性(見圖5c、5d)；術后12周時，受壓節(jié)段脊髓神經(jīng)元細胞變性明顯，部分神經(jīng)元細胞出現(xiàn)壞死，細胞核固縮，白質(zhì)出現(xiàn)彌漫性脫髓鞘改變，軸突空泡樣變性更加明顯(見圖5e、5f)。

圖3 球囊注射造影劑后X線表現(xiàn) 圖4 末次注射后CT橫斷面圖像

a 對照組正常神經(jīng)元細胞 b 對照組正常白質(zhì)和軸突

c 實驗組術后8周神經(jīng)元細胞變性、萎縮 d 實驗組術后8周輕度脫髓鞘和空泡變性

e 實驗組術后12周神經(jīng)元細胞壞死 f 實驗組術后12周彌漫脫髓鞘和軸突空泡變性

圖5 脊髓慢性壓迫神經(jīng)病理學改變(HE，×100)

3 討 論

隨著人類對于慢性壓迫性頸脊髓病的認識不斷完善，其對于患者及社會往往會造成很嚴重的后果，因此對于脊髓壓迫的機制研究也從未停止，而建立理想可靠的動物模型對該疾病的研究尤為重要。1999年，Pinazo等用肝腫瘤細胞植入的方法模擬脊髓壓迫過程，通過觀察腫瘤細胞對局部組織的誘導生長，從而造成對脊髓的慢性壓迫[8]。Klironomos等[9]用新西蘭兔進行脊髓壓迫實驗，在兔的C7椎板下方植入芳香聚合物，利用芳香聚合物吸水后可以膨脹的特性，在建模后20周，芳香聚合物誘導形成骨贅以及其本身的膨脹結果，造成對脊髓持續(xù)的慢性壓迫，成功建立了慢性脊髓壓迫動物模型。Hukuda等[10]用犬進行脊髓壓迫實驗，首次采用頸前路入路將螺釘擰入實驗動物C4椎體，然后每天將螺釘擰入1個螺距(約1 mm)，直至實驗動物出現(xiàn)脊髓神經(jīng)功能變化，該方法在當時被廣泛應用。而Kanchiku等[11]通過進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，螺釘擰入壓迫脊髓產(chǎn)生的是一種非線性壓力變化，由于脊髓在椎管內(nèi)有一定的空間，在螺釘擰入的早期，對脊髓壓迫有限，實驗動物不會出現(xiàn)脊髓受壓后的神經(jīng)功能變化，而隨著螺釘?shù)倪M一步擰入，即使螺釘擰入的深度很小，脊髓也會出現(xiàn)明顯的受壓改變，最終導致受壓脊髓神經(jīng)細胞的損害。螺釘擰入的方法雖然能模擬脊髓受壓的過程，但是設計本身也存在很多的缺陷，比如金屬螺釘本身對于脊髓周圍組織的刺激、手術后傷口的感染、實驗造成的脊髓壓迫是否是慢性壓迫仍有爭議。而隨著醫(yī)學的發(fā)展，科學家也進一步發(fā)現(xiàn)頸部脊髓壓迫過程絕不是簡單的機械壓迫，除了常見的骨質(zhì)增生、骨贅的形成造成的骨性壓迫外，椎間盤退化突出、后縱韌帶骨化、黃韌帶增生肥厚，甚至是腫瘤的生長都可能對脊髓形成慢性持續(xù)性壓迫。2012年Lee等[12]采用大鼠作為動物模型，用自制的金屬頸椎后路慢性脊髓壓迫裝置植入實驗動物體內(nèi)，成功建模，該模型很好的模擬了脊髓壓迫的過程，更重要的是，該動物模型的壓迫過程可以量化，能夠更好的記錄實驗動物的神經(jīng)功能學表現(xiàn)、病理生理學表現(xiàn)與量化的壓迫之間的關系，在臨床轉化的相關研究中具有重要意義。

本實驗選擇山羊為動物模型，而非以往采用的犬、兔、鼠等小型動物，主要是因為山羊的頸椎更長，更接近人類的頸椎，其次山羊為大型動物，其對于麻醉及手術的耐受較小型動物更加強，術后并發(fā)癥也更少，而本實驗中也確實未發(fā)生實驗動物因為麻醉及手術而發(fā)生意外死亡的情況，再一次證明采用大型動物建模的成功率更加高。

本實驗中慢性脊髓壓迫裝置以醫(yī)用聚乙烯螺釘和導尿管構成，并不是金屬螺釘，主要是基于以下幾點考慮：a)聚乙烯材料和導尿管材料相較于金屬材料而言，對于實驗動物的組織刺激更小，組織相容性更加優(yōu)越；b)導尿管頭端的球囊壓迫裝置，質(zhì)地軟，與金屬螺釘直接擰入相比，可以避免與硬膜囊表面的直接接觸而造成損傷；c)采用非金屬材質(zhì)制作壓迫裝置，在術后進行CT檢查時可以避免金屬材質(zhì)產(chǎn)生的偽影而對實驗影像結果產(chǎn)生影響，本實驗也由于條件有限，未能對實驗動物進一步進行磁共振檢查，但非金屬材料裝置的設計，除了價格低廉，也更利于重復建模，術后影像學檢查評估途徑也更加廣泛；d)本實驗中建模后將導尿管固定于體表外，每次只要經(jīng)由尾端注射器向球囊內(nèi)注射造影劑，避免了每次擰入金屬螺釘重復打開傷口對實驗動物的傷害，也減少了傷口感染的概率。

本實驗研究結果顯示，實驗組在建模4周時，球囊隨著持續(xù)注入造影劑而不斷增大，但所有實驗動物均未出現(xiàn)脊髓神經(jīng)功能障礙，而到了第8周時實驗組有三只山羊出現(xiàn)了神經(jīng)癥狀，不能跳躍，但能跑動(Tarlov 評分均為4分)，到了第12周時，又有5只山羊出現(xiàn)了不同程度的脊髓神經(jīng)功能障礙，而且Tarlov評分更加低，表明脊髓神經(jīng)損傷更加嚴重，結合相同時間點的影像學檢查及病理檢查結果，我們可以看到隨著受壓節(jié)段脊髓受壓程度的加深，受壓節(jié)段脊髓神經(jīng)元細胞變性逐漸加重，甚至出現(xiàn)壞死，白質(zhì)脫髓鞘改變及軸突空泡樣變性也逐漸加重。我們推測在實驗早期，球囊雖然造成一定壓迫，但是椎管內(nèi)本身存在一定空間，脊髓腹側受壓后可以適度向背側移動，只有隨著壓迫進一步加重，避讓空間消失后才出現(xiàn)一定的神經(jīng)運動功能障礙。這與臨床上的現(xiàn)象相一致：即慢性脊髓型頸椎病早期癥狀輕，可以持續(xù)數(shù)年甚至數(shù)十年無加重，而隨著壓迫程度的不斷累積，當?shù)竭_某一個臨界點時，病情可以在短時間內(nèi)突然加重，甚至出現(xiàn)嚴重的脊髓運動功能障礙。因此我們建議在頸椎病早期癥狀較輕時就應該引起重視，提早干預，以免壓迫進一步加重，造成嚴重的脊髓損傷。

本實驗中實驗動物建模手術方法簡單，手術時間一般可以控制在30 min左右，手術創(chuàng)傷小；而且球管固定于體外，可以避免反復多次切開，降低了傷口感染的風險；脊髓受壓為腹側壓迫，能很好地模擬臨床中脊髓腹側慢性受壓的機制。上述這些優(yōu)點為該建模方法的實用性、可重復性提供了基礎。但本實驗研究也存在一些不足之處，比如山羊為大型動物，價格較高，飼養(yǎng)成本更大，所以本實驗樣本量較??；其次是不同時間點用球管尾端針筒向球囊內(nèi)注射定量的造影劑，實驗中我們發(fā)現(xiàn)針筒內(nèi)推管有部分退出，每次注射的量無法精確控制；第三，本實驗觀察周期為12周，實驗結束無一例實驗動物出現(xiàn)肢體完全癱瘓，這可能與實驗設計時間太短而對實驗動物脊髓壓迫程度不夠有關。因此本實驗尚需加大樣本量，精確控制每一次注射量，延長觀察時間，優(yōu)化實驗步驟，對慢性壓迫性脊髓損傷的后續(xù)進展和轉歸做更加深入的統(tǒng)計和分析，更好地實現(xiàn)該動物模型的科研應用價值。