MicroRNA-29b表達(dá)改變對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響

季曉微， 王 琳， 徐 軍， 劉素英， 董 曦

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200032

卵巢癌已成為目前威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一。卵巢癌早期發(fā)病隱匿，缺乏特異性高的診斷技術(shù)，超過70%的患者在確診時(shí)已處于晚期；并且其侵襲速度快、復(fù)發(fā)率高，患者的5年生存率低于30%[1]。因此，探索特異性強(qiáng)、靈敏度高的診療靶點(diǎn)成為目前亟待解決的熱點(diǎn)問題。

MicroRNA(miRNA)是一類具有調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄水平的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，能通過與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)功能基因表達(dá)的調(diào)控，從而參與多種腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等惡性生物學(xué)行為的調(diào)控[2]。研究證實(shí)，miRNA-29b是一種能夠發(fā)揮抑癌作用的microRNA分子。目前已經(jīng)在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)miRNA-29b的表達(dá)異常下降，包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌、黑素瘤等多種腫瘤[3-4]。因此，本研究擬觀察miRNA-29b對(duì)人卵巢癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用及其分子機(jī)制，旨在為卵巢癌的早期診斷和靶向治療提供潛在的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人卵巢癌上皮細(xì)胞系SKOV-3及人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；細(xì)胞培養(yǎng)試劑(DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈霉素青霉素、胰蛋白酶)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒Cell Counting Kit-8購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；ECL化學(xué)發(fā)光試劑和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；miRNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miRNA-29b mimic、mimic control miRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，miRNA-29b和U6引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成，其他常用生化試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌上皮細(xì)胞系SKOV-3及人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80復(fù)蘇后，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2，每天更換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度>80%進(jìn)行消化、傳代和接種，用于后續(xù)研究。

1.3 miRNA-29b表達(dá)水平的檢測(cè) 采用real-time PCR檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞和IOSE80細(xì)胞中miRNA-29b表達(dá)水平。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV-3細(xì)胞和IOSE80細(xì)胞，使用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，使用熒光定量試劑進(jìn)行定量，miRNA-29b表達(dá)檢測(cè)使用U6作為內(nèi)參。miRNA-29b相對(duì)表達(dá)按照2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞消化收集，按照106/孔的密度接種于六孔板中，經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑按照試劑盒操作方案將miRNA-29b mimic和mimic control miRNA分別轉(zhuǎn)染到SKOV-3細(xì)胞中。將細(xì)胞分為空白組(Blank)、陰性對(duì)照組(Negative control)及miRNA-29b轉(zhuǎn)染組(miRNA-29b)。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8試劑檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞增殖能力，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按照104/孔的密度接種于96孔板，細(xì)胞分組同上述3組，實(shí)驗(yàn)操作按照CCK-8試劑盒進(jìn)行，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度(D490)值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖能力。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell法檢測(cè)miRNA-29b轉(zhuǎn)染對(duì)SKOV-3細(xì)胞侵襲能力的影響。使用濃度為1 mg /mL的Matrigel膠體提前將Transwell培養(yǎng)板的上室進(jìn)行包被，下室加入DMEM培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)24 h后取出，放置于顯微鏡下隨機(jī)選取視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 細(xì)胞蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western 印跡法檢測(cè)細(xì)胞中蛋白的表達(dá)水平。細(xì)胞分組同上，使用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞得到總蛋白，使用BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量，使用SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，使用PVDF膜進(jìn)行電轉(zhuǎn)，經(jīng)4℃封閉過夜，次日使用相應(yīng)二抗孵育后通過ECL試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，定量檢測(cè)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-29b在不同細(xì)胞中的表達(dá)差異 結(jié)果(圖1)顯示：人卵巢癌上皮細(xì)胞系SKOV-3細(xì)胞中miRNA-29b的表達(dá)顯著下降，與人正常卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 不同細(xì)胞中miRNA-29b的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 miRNA-29b mimic轉(zhuǎn)染對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響 結(jié)果(圖2)表明：SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，細(xì)胞中miRNA-29b的表達(dá)上調(diào)，與陰性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示：轉(zhuǎn)染miRNA-29b組SKOV3細(xì)胞從第4天開始增殖能力下降，明顯低于陰性對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)。而空白組及陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)miRNA-29b表達(dá)能夠抑制SKOV3細(xì)胞增殖。

圖2 各組細(xì)胞中miRNA-29b的表達(dá)水平

圖3 各組細(xì)胞增殖能力的對(duì)比

2.3 miRNA-29b轉(zhuǎn)染對(duì)SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響 結(jié)果(圖4)顯示：轉(zhuǎn)染miRNA-29b顯著減少了通過聚碳酸酯膜的SKOV3細(xì)胞數(shù)量，抑制了SKOV3細(xì)胞的侵襲能力，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而空白組及陰性對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 miRNA-29b轉(zhuǎn)染對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9表達(dá)的影響 結(jié)果(圖5)顯示：轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中抑制凋亡蛋白Bcl-2和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9的表達(dá)均下調(diào)，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白組及陰性對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 各組細(xì)胞侵襲能力的對(duì)比

圖5 各組細(xì)胞中Bcl-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的對(duì)比

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生涉及人體多種原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失衡。與其他惡性腫瘤一樣，卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是多因素影響下的多基因、多步驟的惡性增殖的動(dòng)態(tài)過程，其中miRNA所調(diào)控的基因表達(dá)機(jī)制在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。miRNA-29是在2003年由Dostie等[5]在人神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，其編碼序列位于人體染色體的1q32.2:207801852-207801939位點(diǎn)。miRNA-29家族成員主要包括miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-29c，其中miRNA-29b主要定位于細(xì)胞核中，能夠與多種目標(biāo)靶基因的mRNA發(fā)生特異性結(jié)合，從而在調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)水平[5]。Wang等[6]研究證實(shí)，人乳腺癌組織中miRNA-29b的表達(dá)異常增加；以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為模型，發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-29b的表達(dá)后能夠促進(jìn)抑癌蛋白PTEN的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。而在人前列腺癌細(xì)胞PC3和LNCaP中，miRNA-29b的表達(dá)下降；通過慢病毒轉(zhuǎn)染增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞中miRNA-29b的表達(dá)水平，能夠顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力，其作用可能與E-cadherin相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)[7]。在原發(fā)性肝癌中，血清miRNA-29b的表達(dá)下降程度與患者的疾病進(jìn)展和預(yù)后顯著相關(guān)，證實(shí)miRNA-29b在原發(fā)性肝癌中發(fā)揮抑癌作用[8]。本研究中，人卵巢癌上皮細(xì)胞系SKOV-3細(xì)胞中miRNA-29b的表達(dá)下降；與IOSE80細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，SKOV-3細(xì)胞中miRNA-29b的表達(dá)水平增加，SKOV3細(xì)胞增殖能力從第4天開始下降，同時(shí)SKOV3細(xì)胞的侵襲能力下降，初步證實(shí)了miRNA-29b在卵巢癌中發(fā)揮了抑癌基因的作用。

B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)是重要的細(xì)胞凋亡蛋白之一。研究認(rèn)為，Bcl-2能夠顯著抑制由多種細(xì)胞毒因素(如化療)所引起的凋亡機(jī)制，同時(shí)能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA損傷因子的抗性，可作為原發(fā)性上皮性卵巢癌的耐藥性和預(yù)后判斷的預(yù)測(cè)因子[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9, MMP-9)能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的鋅離子依賴型內(nèi)肽酶，與多種惡性腫瘤的侵襲性密切相關(guān)[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9在卵巢癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與卵巢癌患者的生存期負(fù)相關(guān)[11]。而Zou等[12]的研究顯示，MMP-9調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力是與IL-6的介導(dǎo)作用密切相關(guān)。轉(zhuǎn)染miRNA-29b mimic后，卵巢癌細(xì)胞SKOV3中侵襲相關(guān)蛋白MMP-9的表達(dá)降低，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，具有作為卵巢癌早期診斷和靶向治療的分子靶點(diǎn)的潛在價(jià)值，其作用可能通過抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和侵襲相關(guān)蛋白MMP-9的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。