堿性蛋白酶產生菌培養(yǎng)分離和酶活力測定

段毓佳 魯良 石達 毛爽

摘 要：篩選出4種可以產生堿性蛋白酶的菌株，分別編號1，2，3，4，通過菌株的生長情況，菌落的特征等這4種菌株進行分離，進步的純化，制備酶活力測定的標準曲線。4種菌株在25℃條件下，酶活力有大有小，最大的為168um/min左右，最小酶活力在21um/min左右。

關鍵詞：堿性蛋白酶；培養(yǎng)；分離；酶活力

堿性蛋白酶是指PH在9-11的堿性條件下能夠水解蛋白質肽鍵的酶類，由于其活性中心含Ser，故屬于絲氨酸蛋白酶。有數(shù)據(jù)顯示，全世界工業(yè)用酶每年銷售額大約為1億美元，在所有的工業(yè)用酶制劑中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工業(yè)用酶中占據(jù)比例最大的酶類，大約占全世界每年總銷售量的60%左右。堿性蛋白酶在食品，洗滌、絲綢、飼料、醫(yī)藥、環(huán)保以及制革等行業(yè)中，有著廣泛的用途，因此具有很強工業(yè)與經濟價值。由于微生物蛋白酶均為胞外酶，與動、植物源蛋白酶相比具有下游技術處理相對簡單、價格低廉、來源廣、菌體易于培養(yǎng)、產量高、高產菌株選育簡單、快捷，具有動植物蛋白酶所具有的全部特性，堿性蛋白酶比中性蛋白酶具有更強的水解能力和耐堿能力，有較大耐熱性，有一定的酯酶活力。因此，堿性蛋白酶研究成為蛋白酶研究的熱點。

一、實驗

1.菌株及其培養(yǎng)基。菌株的獲得：從邢臺學院餐廳附近的垃圾池旁收集土壤。牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基：牛肉膏 3g，蛋白胨10g，NaCl5g，1000ml水，PH值7.4-7.6； 酪蛋白培養(yǎng)基：酪蛋白2.5g，酵母膏5g，瓊脂10g，500ml水，PH 值9.0；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2.5g，蛋白胨5 g，酵母膏2.5g，NaCl2.5g，500ml水，PH 值9.0；發(fā)酵培養(yǎng)基： 葡萄糖2.5g，蛋白胨5 g，酵母膏25g， K2HPO4 5g，MnSO4 20g，500ml水，PH 值9.0。

2.儀器。三角瓶，高壓滅菌鍋，培養(yǎng)皿，試管，酒精燈，燒杯，電爐，濾紙，漏斗，玻璃棒，生化恒溫培養(yǎng)箱，震蕩培養(yǎng)箱，電子天平，722型可見分光光度計。

3.方法

（1）菌株的培養(yǎng) 。將少量取樣的土壤加入無菌水進行稀釋，混勻，靜置，之后再進行取少量上層清液分別稀釋100倍，用滴管吸取少量的稀釋液在酪蛋白培養(yǎng)上滴加一滴，然后用玻璃環(huán)在培養(yǎng)基上涂布，25℃恒溫培養(yǎng)48h。挑取產生透明圈的菌株在酪蛋白培養(yǎng)中進一步純化，同時進行平板劃線25℃培養(yǎng)，和接種到斜面培養(yǎng)基保存。根據(jù)平板劃線菌株生長的情況，選取適宜的菌株進行振蕩培養(yǎng)。分別挑取平板劃線培養(yǎng)基上的菌，接種到種子培養(yǎng)基上進行震蕩培養(yǎng)48h。

（2）菌株的分離。將經純化分離得到的菌株，點種于酪蛋白培養(yǎng)基中，進行初步酶活力測定，根據(jù)點種菌株的情況，分別記錄4種菌株的情況。

（3） 菌株產生酶的活力測定。 將分離得到的適宜菌株接種到100ml左右種子培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)24h，以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基28℃振蕩培養(yǎng)48h，發(fā)酵液3000r每分鐘，離心15min，取上清液，采用Folin-酚法測定蛋白酶活力。

（4）標準曲線的制定。取6支試管，標號按照下面的配比操作，加入5ml碳酸鈉溶液及0.5mlFolin-酚試劑，迅速混勻，于40攝氏度恒溫水浴中顯色20min，取出后用流水冷卻，在分光光度計上以1號管為對照測定各管的吸光度（A680），以酪氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

二、結果和分析

1.菌株的篩選。經酪蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)后，在培養(yǎng)基上產生明顯透明圈的只有4種菌株，將其編號為1，2，3，4號，據(jù)測量發(fā)現(xiàn)菌株2和3的D/d值比較大，同時也比較接近，而菌株1和4的D/d值比較小，菌株的比值最大。

2.菌株分類。菌體特征：表面褶皺，扁平而大白色；表面光滑，小也有突起淡黃色；表面相對光滑，高聳而大黃色；菌落邊緣褶皺，高聳而大白色

3.菌株酶活力的測定。由多組數(shù)據(jù)點0.165，0.213，0.464，0.406，0.772等得出標準曲線的方程式：y=-0.036+0.0147x、25度下各菌株酶活力測定結果如下。

三、結論與討論

從富含蛋白質的土壤中分離出來的4種菌株都具有產生堿性蛋白酶的能力，并對它們各自的菌落特征進行記錄。經測定25度下各菌株酶活力，得知酶活力的強弱。通過實驗可以獲得酶活力比較高的菌株，但是還是不能滿足工業(yè)等生產的實際應用。

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通訊作者：唐蕊（教授）