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    關(guān)于BnTR1基因抑制不同分化程度的腫瘤細(xì)胞增殖的初步探討

    2018-07-28 07:21:26向俊蓓萬(wàn)謙
    科技資訊 2018年7期

    向俊蓓 萬(wàn)謙

    摘 要:為研究耐熱基因BnTR1對(duì)不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用,構(gòu)建BnTR1條件表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染4種不同分化程度的腫瘤細(xì)胞。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示BnTR1的表達(dá)水平在幾種腫瘤細(xì)胞中相近;MTT檢測(cè)結(jié)果顯示HGC和AGS的細(xì)胞增殖受到抑制,抑制作用HGC > AGS,而HT-29和MCF-7的細(xì)胞增殖不受到抑制。推斷BnTR1對(duì)于分化程度低的腫瘤細(xì)胞增殖有抑制作用,而對(duì)于分化程度高的腫瘤細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制。

    關(guān)鍵詞:BnTR1 腫瘤啟動(dòng)子 腫瘤細(xì)胞的分化程度

    中圖分類號(hào):S853.53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1672-3791(2018)3(a)-0000-00

    BnTR1基因(GU204975.1)來源于甘藍(lán)型油菜 [1],在植物中的功能包括抗熱脅迫、抗鹽脅迫等[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)BnTR1對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela和人肺癌細(xì)胞A549的增殖具有抑制作用,該抑制作用可以與抗癌化學(xué)藥物順鉑cisplatin對(duì)Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞的增殖抑制作用協(xié)同[3]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),BnTR1編碼一種泛素系統(tǒng)的E3連接酶,能對(duì)多種蛋白質(zhì)包括某些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行泛素化[1,3-5]; BnTR1發(fā)揮抗脅迫功能和抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能,必須有其N端蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的RING結(jié)構(gòu)域的存在[1,5]。由于人腫瘤細(xì)胞按不同標(biāo)準(zhǔn)可以分成許多不同類型,包括按分化程度的不同,可以大致劃分為未分化、低分化和高分化,而其惡性程度的排序是:未分化>低分化>高分化。同時(shí),不同分化程度的腫瘤細(xì)胞對(duì)于干預(yù)作用的反應(yīng)是有差異的。因此,BnTR1能夠抑制人腫瘤細(xì)胞增殖的特性值得深入研究。

    基于此目的,研究中構(gòu)建BnTR1條件表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染多種腫瘤細(xì)胞(人胃癌細(xì)胞HGC(未分化腫瘤細(xì)胞)、人胃癌細(xì)胞AGS(低分化腫瘤細(xì)胞)、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29(高分化的腫瘤細(xì)胞)、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7(高分化的腫瘤細(xì)胞))后,分別進(jìn)行Western blot檢測(cè)和MTT檢測(cè),分析TR1表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)的聯(lián)系。

    1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

    1.1 條件表達(dá)載體構(gòu)建

    (1)全基因合成人腫瘤基因c-ErbB-2的啟動(dòng)子序列,在5末端加上限制性內(nèi)切酶AflII的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基,同時(shí)在3末端加上限制性內(nèi)切酶BamHI的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。利用基因克隆技術(shù),將合成的全基因序列整合到pcDNA 3.1(+)上的AflII和BamHI的酶切位點(diǎn)之間,備用;高保真PCR酶擴(kuò)增BnTR1全cDNA片段,并且分別在5端和3端加上BamHI和EcoRI序列和保護(hù)堿基,同時(shí)在5端BamHI的位點(diǎn)后加入蛋白質(zhì)片段標(biāo)記Flag tag,備用;

    (2)利用基因克隆技術(shù),拼接前述備用DNA片段,構(gòu)建目標(biāo)載體pcDNA 3.1(+)-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1。擴(kuò)增質(zhì)粒中插入BnTR1片段;測(cè)序驗(yàn)證序列正確性。

    1.2 腫瘤細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

    分別培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞包括HGC(未分化)、AGS(低分化)、HT-29(高分化)、MCF-7(高分化),并進(jìn)行質(zhì)粒pcDNA 3.1(+)-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染[7]:每種處理6孔重復(fù),質(zhì)粒pcDNA 3.1(+)做為對(duì)照;

    1.3 Western blot檢測(cè)

    收獲轉(zhuǎn)染BnTR1的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞并分別提取蛋白質(zhì)混合物,Western blot[8]檢測(cè)BnTR1的表達(dá)。使用兔抗BnTR1血清(自制抗血清)和兔抗人Beta-actin的一抗(中杉金橋,中國(guó)),小鼠抗兔的帶辣根過氧化物酶(HRP)的二抗(中杉金橋,中國(guó)),ECL溶液購(gòu)自碧云天公司。

    1.4 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖

    瞬時(shí)轉(zhuǎn)染72小時(shí)后,使用MTT法[9]檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的增殖情況。使用MTT原液(0.5 mg/ml)(Sigma Inc.,USA);二甲基亞砜DMSO(Sigma Inc.,USA);

    檢測(cè)波長(zhǎng)為570nm,參比波長(zhǎng)為655 nm。

    1.5 數(shù)據(jù)分析

    每種條件獲得6個(gè)OD570nm的數(shù)據(jù),去除最高值和最低值,分析中分別對(duì)比轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1(+)-c-ErbB-2-Flag tag-BnTR1的實(shí)驗(yàn)組和轉(zhuǎn)染pcDNA 3.1(+)的對(duì)照組,使用軟件SPSS 19.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)量均值。

    2 結(jié)果

    2.1 載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

    測(cè)序結(jié)果顯示BnTR1條件表達(dá)載體構(gòu)建成功,Western結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后,BnTR1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平在HGC、AGC、HT-29和MCF-7中相近。

    2.2 不同腫瘤細(xì)胞的增殖情況

    HGC和AGS細(xì)胞的增殖受到BnTR1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的顯著抑制(P = 0.03和P = 0.02),抑制率分別是17%和10%;而HT-29和MCF-7細(xì)胞的增殖未受到BnTR1的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的顯著抑制(P = 0.81和P = 0.39)。

    3 討論

    研究中選擇腫瘤基因c-ErbB-2的啟動(dòng)子,c-ErbB-2是一種腫瘤基因,具有在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的特點(diǎn)。結(jié)果表明不同腫瘤細(xì)胞經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后,BnTR1的表達(dá)水平相近,而不同腫瘤細(xì)胞對(duì)于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的反應(yīng)性有差異。表達(dá)質(zhì)粒對(duì)于處于未分化程度的HGC和處于低分化程度的AGS的增殖能限制抑制,而對(duì)高分化程度的HT-29和MCF-7的增殖不抑制,分化程度越低,BnTR1的抑制作用越顯著。有文獻(xiàn)報(bào)道BnTR1能抑制Hela和A549細(xì)胞的增殖[5],而Hela和A549均為分化程度低的腫瘤細(xì)胞,故本研究結(jié)論為BnTR1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制功能與細(xì)胞分化程度的相關(guān)性提供了新的支撐數(shù)據(jù)。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Liu ZB, Wang JM, Yang FX, Yang L, Yue YF, Xiang JB, Gao M, Xiong FJ, Lv D, Wu XJ, Liu N, Zhang X, Li XF, Yang Y. A novel membrane-bound E3 ubiquitin ligase enhances the thermal resistance in plants. Plant Biotechnol.J.,2014,12(1):93-104.

    [2] 陳彩麗,曹昊昊,樊莉娟,等.過量表達(dá)BnTR1油菜對(duì)多種逆境的抗性分析.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2017,54(1):215-220.

    [3] Qian Wan, Zhibin Liu, Wenzhen Peng, Jianmei Wang, Xufeng Li, Yi Yang. BnRCH gene inhibits cell growth of Hela cells through increasing the G2 phase of cell cycle.Human Cell,2011,240:150-160.

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