粉碎細(xì)度與濾袋對(duì)飼草NDF與ADF含量的影響

， ， ， ，

(1.山東省畜牧總站， 山東省草產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)中心， 山東 濟(jì)南 250022； 2. 山東晟益牧業(yè)有限公司， 山東 濟(jì)南 250121)

1963年，Van Soest提出了用中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)替代粗纖維(crude fiber，CF)作為評(píng)定飼草中纖維類(lèi)物質(zhì)的指標(biāo)，以準(zhǔn)確反映飼草中纖維的可消化利用程度[1]。我國(guó)先后頒布的豆科牧草干草(Legume hay)、苜蓿干草捆(Bale of alfalfa hay)、草顆粒(Forage pellet)、草塊(Forage cubes)和青貯玉米(Silage maize)質(zhì)量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均把NDF或NDF和ADF作為質(zhì)量分級(jí)參數(shù)，同時(shí)中國(guó)飼料原料數(shù)據(jù)庫(kù)飼料常規(guī)養(yǎng)分表也自2000年引入這兩項(xiàng)指標(biāo)，因此NDF和ADF快速準(zhǔn)確測(cè)定已成為判定飼草質(zhì)量等級(jí)和科學(xué)配置牛羊日糧的重要前提[2-3]。

我國(guó)于2006年和2007年先后頒布了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20806—2006和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1459—2007，分別規(guī)范了飼料中NDF和ADF含量的測(cè)定，其操作方法均為抽濾法。但該方法操作過(guò)程控制難、耗時(shí)長(zhǎng)，尤其是抽濾過(guò)程常常因樣品堵塞過(guò)濾眼而延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間、影響樣品清洗程度，造成檢測(cè)效率低、誤差大[4]。為了提高檢測(cè)效率和精確度，自上個(gè)世紀(jì)90年代以來(lái)，濾袋法檢測(cè)技術(shù)被逐步研究與應(yīng)用[5]，1993年美國(guó)ANKOM科技公司推出ANKOM纖維分析儀，實(shí)現(xiàn)了濾袋法檢測(cè)技術(shù)的全自動(dòng)化操作。

影響濾袋法測(cè)定結(jié)果的兩個(gè)重要因素是樣品的粉碎細(xì)度與濾袋，兩者緊密相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，樣品粉碎越細(xì)，NDF和ADF含量越低，田雨佳等[4]認(rèn)為這是樣品微粒流出濾袋造成的，并建議樣品粉碎細(xì)度為9目(2.00mm)，但未給出濾袋孔徑大小參數(shù)。而Vogel等[8]和薛紅楓等[9]采用ANKOM公司 F57濾袋 (孔徑為25μm)測(cè)定粉碎細(xì)度為18目(1.00mm)的試樣，其N(xiāo)DF與ADF含量與國(guó)標(biāo)法差異不顯著。目前市場(chǎng)推出了更小孔徑的濾袋，如ANKOM F58濾袋(孔徑為10μm)，而相應(yīng)的樣品粉碎細(xì)度參數(shù)研究未見(jiàn)報(bào)道。另外，一些學(xué)者對(duì)不同材質(zhì)的纖維濾袋[9]、尼龍布濾袋[7, 10]、聚酯布濾袋[11]等在NDF和ADF測(cè)定中的應(yīng)用做出了有益的探索，但由于樣品、檢測(cè)方法的不同，結(jié)果并不一致。本試驗(yàn)就粉碎細(xì)度、濾袋材質(zhì)和孔徑大小對(duì)濾袋法測(cè)定飼草中NDF和ADF含量的影響進(jìn)行了研究，以期為濾袋法測(cè)定飼草NDF和ADF含量提供粉碎細(xì)度參數(shù)和濾袋篩選依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取自山東省內(nèi)草捆、草粉、草顆粒和青貯飼料4大類(lèi)10種飼草為試驗(yàn)樣品。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1不同粉碎細(xì)度處理 設(shè)計(jì)9目(2.00 mm)、18目(1.00 mm)和40目(0.45 mm)3個(gè)粉碎細(xì)度處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，用ANKON F58纖維濾袋(特制無(wú)紡布、孔徑10 μm、ANKOM公司提供)測(cè)定不同粉碎細(xì)度下10種飼草NDF和ADF含量。同時(shí)，將試驗(yàn)樣品裝入ANKON F58纖維濾袋，用蒸餾水浸泡，測(cè)定樣品微粒流失率、溶水率和總失重率。

1.2.2不同濾袋處理 選擇聚酯布、尼龍布和無(wú)紡布3種材質(zhì)制作成濾袋，聚酯布分國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口，孔徑為400目(37 μm)、600目(23 μm)、800目(18 μm)，尼龍布孔徑為400目、800目、1200目(12 μm)、1600目(10 μm)，無(wú)紡布為孔徑400目普通無(wú)紡布(國(guó)產(chǎn)聚酯布、尼龍布和無(wú)紡布均由浙江中科環(huán)保濾料有限公司提供；進(jìn)口聚酯布為ANKOM technology, Macedon, NY, USA生產(chǎn))、CAU濾袋[7](特制無(wú)紡布、孔徑20 μm、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)肉牛研究中心提供)和ANKON F58纖維濾袋。不同材質(zhì)和孔徑濾袋共13個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，以ANKON F58纖維濾袋為對(duì)照，測(cè)定苜蓿干草捆樣品(過(guò)40目網(wǎng)篩)NDF和ADF含量。

1.2.3樣品制備 采集的草捆、草粉、草顆粒先用鍘草粉碎機(jī)粗粉，再用實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)(HK-08B，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)細(xì)粉至過(guò)9目、18目和40目網(wǎng)篩，充分混合后用四分法縮分至100 g，裝袋，為試驗(yàn)樣品。青貯飼料先用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱在65℃下烘干24 h，再按上述方法粉碎、縮分、裝袋，制成試驗(yàn)樣品。

1.2.4濾袋的制作 裁剪普通無(wú)紡布、聚酯布和尼龍布，用封口機(jī)(AIE-200，美國(guó)通用電氣公司)壓制成5 cm×6 cm的濾袋，樣品裝入后用封口機(jī)封口。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1儀器與試劑 全自動(dòng)纖維分析儀：ANKOM 2000i，美國(guó)ANKOM技術(shù)有限公司。

離心機(jī)：DT5-2，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司。

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9123A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

耐高溫α-淀粉酶及稀釋液：100℃±5℃溫度下活性為8 000 U·g-1，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。8.0 mL α-淀粉酶加水稀釋至250 mL，配成α-淀粉酶稀釋液。

中性洗滌劑：18.61 g乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、 6.81 g四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O)、4.56 g 無(wú)水磷酸氫二鈉(Na2HPO4)、30.00 g十二烷基硫酸鈉(USP)各自加適量溫水溶解，冷卻后混合，加入10 mL三甘醇(C6H14O4)或乙二醇乙醚(C4H10O2)，加水定容至1 000 mL。

酸性洗滌劑：20.00 g十六烷基三甲基溴化銨，溶解于1 000 mL 0.05 mol·L-1硫酸溶液中，適當(dāng)加熱，攪拌溶解。

1.3.2失重率的測(cè)定 稱(chēng)取烘干試樣0.5 g，裝入烘干并稱(chēng)重和標(biāo)號(hào)的濾袋，封口；放入烘干并稱(chēng)重和標(biāo)號(hào)的80 mL塑料離心管，移入50 mL蒸餾水，振蕩2 h；取出濾袋，在102℃±2℃下烘干至恒重，稱(chēng)重，計(jì)算樣品失重率；離心管在2800×g離心力下離心5 min，倒去上清液，在102℃±2℃下烘干至恒重，稱(chēng)重，計(jì)算樣品微粒流失率；用樣品失重與微粒失重之差與樣品重的比值，計(jì)算樣品溶水率。

1.3.3NDF的測(cè)定 稱(chēng)取烘干試樣0.5 g，裝入濾袋，封口。置于燒杯中，加入丙酮浸泡振蕩洗滌3次，風(fēng)干后置入全自動(dòng)纖維分析儀濾袋架。自動(dòng)加入中性洗滌液2 000 mL，手動(dòng)加入20 g無(wú)水亞硫酸鈉，100℃ 消煮1 h，70℃ 溫水沖洗4次，濾袋移入燒杯，丙酮浸泡3～5 min，取出晾干，在102℃±2℃下烘干至恒重，稱(chēng)重，計(jì)算樣品NDF含量。置入空白濾袋參與全部操作過(guò)程，計(jì)失重比例為校正因子。全株玉米青貯飼料樣品在消煮時(shí)加入4.0 mL ɑ-淀粉酶，并在熱水洗滌時(shí)加入250 mL ɑ-淀粉酶稀釋液。

1.3.4ADF的測(cè)定 采用連續(xù)法測(cè)定ADF的含量。將測(cè)定NDF后的濾袋重新放入全自動(dòng)纖維測(cè)定儀濾袋架，自動(dòng)加入酸性洗滌劑2 000 mL，100℃消煮1 h，70℃溫水沖洗4次，濾袋移入燒杯，丙酮浸泡3～5 min，取出晾干，在102℃±2℃下烘干至恒重，稱(chēng)重，計(jì)算樣品ADF含量。置入空白濾袋參與全部操作過(guò)程，計(jì)失重比例為校正因子。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粉碎細(xì)度處理的失重率

9目、18目和40目粉碎細(xì)度下樣品在F58濾袋中的失重率見(jiàn)圖1。由圖顯示，樣品粉碎細(xì)度從9目增加至40目，微粒流失率、溶水率和總失重率均無(wú)顯著性差異，變化范圍分別為1.37%～1.86%、12.07%～12.69%和13.68%～14.55%。表明，F(xiàn)58濾袋可有效阻止樣品微粒的流失。

2.2 不同粉碎細(xì)度處理的NDF含量

10個(gè)飼草樣品經(jīng)過(guò)9目、18目和40目粉碎細(xì)度處理后的NDF含量見(jiàn)圖2。NDF含量最高的是小麥秸稈和豆秸，達(dá)到70%以上。其次是羊草干草、玉米秸稈青貯飼料、地瓜秧、花生秧和燕麥干草，范圍是50%～70%，苜蓿干草和玉米秸稈在40%～50%，最低的是全株玉米青貯飼料，低于40%。

苜蓿干草、豆秸和花生秧3個(gè)樣品不同細(xì)度處理間NDF含量差異不顯著，其它7個(gè)樣品的NDF含量表現(xiàn)為9目處理顯著高于18目處理和40目處理(P<0.05)。除小麥秸稈18目處理NDF含量顯著高于40目處理外(P<0.05)，其它9個(gè)樣品18目處理和40目處理間的差異不顯著。

圖1 不同粉碎細(xì)度處理的失重率Fig.1 weight losses ratio of dry matter under different treatments

2.3 不同粉碎細(xì)度處理的ADF含量

10個(gè)飼草樣品經(jīng)過(guò)9目、18目和40目粉碎細(xì)度處理后ADF含量見(jiàn)圖3。樣品ADF含量變化與NDF含量關(guān)系密切，由高到低依次為豆秸>小麥秸稈、花生秧、地瓜秧>羊草干草、玉米秸稈青貯飼料、苜蓿干草>燕麥干草、玉米秸稈、全株玉米青貯飼料。

粉碎細(xì)度處理對(duì)樣品ADF含量影響不如對(duì)NDF含量影響明顯，10個(gè)樣品中有6個(gè)樣品各處理間差異不顯著。具體表現(xiàn)為羊草干草、玉米秸稈青貯飼料、小麥秸稈和地瓜秧4個(gè)樣品9目處理的ADF含量顯著高于18目和40目(P<0.05)，玉米秸稈青貯飼料和地瓜秧2個(gè)樣品的ADF含量18目顯著高于40目(P<0.05)，其它樣品各處理間差異不顯著。

圖2 不同粉碎細(xì)度處理的NDF含量Fig.2 NDF content of sample under different finenesses

圖3 不同粉碎細(xì)度處理的ADF含量Fig.3 ADF content of sample under different finenesses

2.4 不同濾袋處理的NDF和ADF含量

不同材質(zhì)和孔徑濾袋處理，樣品NDF和ADF含量見(jiàn)表1。表中數(shù)據(jù)顯示， CAU濾袋測(cè)定樣品的NDF和ADF含量與F58濾袋(CK)差異不顯著，表明，CAU濾袋與F58濾袋材質(zhì)相同，孔徑均較小，在本試驗(yàn)測(cè)定方法中可以替代使用。其它濾袋測(cè)定的NDF含量均與CK處理差異顯著(P<0.05)，ADF含量除尼龍布1 200目和1 600目處理與CK差異不顯著外，其它處理也均與CK處理差異顯著(P<0.05)。表明，普通無(wú)紡布、聚酯布和尼龍布均不能在本試驗(yàn)測(cè)定方法下代替F58濾袋使用。

聚酯布和尼龍布濾袋不同孔徑處理NDF和ADF含量均呈隨目數(shù)增加而增加的趨勢(shì)。普通無(wú)紡布處理NDF含量與聚酯布和尼龍布的400目處理差異不顯著，ADF含量與聚酯布和尼龍布10個(gè)處理的7個(gè)處理無(wú)顯著性差異。

表1 不同濾袋測(cè)定的NDF和ADF含量Table 1 NDF and ADF contents of samples under different filter-bags

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)。同列數(shù)字后不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Note: Mean±standard deviation (n=3).The different letters within the same column mean the significant differences at the 0.05 level

2.5 不同處理的濾袋破損率

13個(gè)濾袋處理在NDF含量測(cè)定過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)濾袋破損現(xiàn)象，而ADF含量測(cè)定后發(fā)現(xiàn)有8個(gè)處理出現(xiàn)濾袋破損情況(見(jiàn)表2)，為封口內(nèi)緣斷裂。破損濾袋材質(zhì)均為聚酯布和尼龍布，且呈現(xiàn)隨目數(shù)增加而增加的趨勢(shì)。濾袋破損率變化范圍為0～100%，其中600目和800目進(jìn)口聚酯布處理破損率為100%，尤以800目進(jìn)口聚酯布濾袋處理破損最為嚴(yán)重，使酸洗過(guò)程中樣品大量流失，導(dǎo)致ADF測(cè)定值出現(xiàn)異常。3個(gè)無(wú)紡布及400目的聚酯布和400目的尼龍布處理未出現(xiàn)濾袋破損現(xiàn)象。

表2 不同材質(zhì)濾袋的破損率Table 2 Damaged rates of filter-bags during ADF determination procedure

3 討論

3.1 粉碎細(xì)度和濾袋對(duì)NDF和ADF含量的影響

范氏法測(cè)定NDF和ADF含量是利用中性洗滌劑和酸性洗滌劑分解植物細(xì)胞內(nèi)容物(如脂肪、淀粉、蛋白質(zhì)和糖類(lèi)等)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，洗滌和過(guò)濾是測(cè)定NDF和ADF含量的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)[1,12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼草樣品經(jīng)18目和40目粉碎處理，NDF含量顯著低于9目處理(P<0.05)，表明樣品細(xì)粉有利于非纖維物質(zhì)的洗滌。錢(qián)文熙[13]對(duì)新鮮苜蓿、青貯玉米、棉籽殼(Cotton seed hull)和大豆(Soybean)的研究也發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)18目、40目和60目(0.25 mm)處理CF含量低于8目(2.00 mm)處理，且測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好，原因是細(xì)粉確保了試驗(yàn)樣品的代表性，并有效擴(kuò)大樣品與試驗(yàn)試劑的接觸面積，能促進(jìn)非纖維物質(zhì)的洗滌。

濾袋是濾袋法測(cè)定NDF和ADF技術(shù)的重要環(huán)節(jié)，其材質(zhì)和孔徑大小對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性影響很大。Lindberg 和 Knutsson[14]試驗(yàn)結(jié)果顯示， 10 μm尼龍袋中裝入18目粗飼料樣品，水浸泡6 h后，干物質(zhì)流失比例變動(dòng)范圍為3.7%～8.5%，顯著低于20 μm尼龍袋。Ankom 技術(shù)認(rèn)為[8]，F(xiàn)57濾袋將有少于5%的樣品微粒(細(xì)度<30 μm)在洗滌中流失，田雨佳等[6]試驗(yàn)表明，這種流失導(dǎo)致了細(xì)粉處理(過(guò)40目網(wǎng)篩)的NDF和ADF含量較粗粉(過(guò)2.00 mm網(wǎng)篩)處理顯著降低(P<0.05)，但試驗(yàn)并未給出濾袋孔徑大小參數(shù)。Van miellen和 Ellis[15]研究認(rèn)為，孔徑為10 μm的濾袋能阻止樣品流失。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，采用孔徑為10 μm 的F58濾袋，飼草樣品粉碎細(xì)度從9目增加至40目，微粒流失率變化范圍為1.37%～1.86%，各處理間差異不顯著。顯然，與F57濾袋比，更小孔徑的F58濾袋有效防止樣品微粒的流失。

Komarek(1993)[16]和Komarek等(1994)[17]研究顯示，濾袋法測(cè)定NDF和ADF含量與傳統(tǒng)抽濾法的差異小于2%。Vogel等[8]和薛紅楓等[9]研究顯示，粉碎細(xì)度為18目的粗飼料樣品用ANKOM公司F57濾袋測(cè)定NDF 和ADF含量，其測(cè)定值與傳統(tǒng)抽濾法差異不顯著。本研究采用ANKOM 公司提供的F58濾袋，孔徑為10 μm，加上材料本身的三維結(jié)構(gòu)，能有效降低樣品微粒的流失，并暢通洗滌液在濾袋內(nèi)外的流動(dòng)，用于測(cè)定18目和40目粉碎處理的樣品，兩者的NDF和ADF含量一致?？紤]到國(guó)標(biāo)法測(cè)定粗蛋白等營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)要求樣品粉碎細(xì)度為40目，為減少樣品粉碎次數(shù)，建議用孔徑為10 μm 的三維無(wú)紡布纖維濾袋測(cè)定飼草中NDF和ADF含量時(shí)，樣品粉碎細(xì)度可為40目。

3.2 適宜濾袋的篩選

濾袋法測(cè)定NDF和ADF含量過(guò)程中，濾袋充當(dāng)了過(guò)濾膜的作用，要求其材質(zhì)具備不易吸水、經(jīng)酸堿和有機(jī)溶劑處理前后質(zhì)量變化小的特點(diǎn)，并且孔徑大小合適，保證洗滌劑的自由流通[11,18]。自上個(gè)世紀(jì)30年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)絲綢[19]、聚酯纖維[11]、尼龍布[7,10]和特制三維無(wú)紡布[7]等材質(zhì)的篩選做了大量有益的探索，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)流通產(chǎn)品主要是ANKOM 公司的纖維濾袋和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)肉牛研究中心的CAU濾袋，材質(zhì)均為特制無(wú)紡布。本研究結(jié)果顯示，用CAU濾袋測(cè)定樣品NDF和ADF含量與ANKOM F58濾袋差異不顯著，這與薛紅楓等[9]和王曉娜等[20]的研究結(jié)果一致。表明，CAU濾袋可以在飼草樣品中替代ANKOM F58濾袋使用，以降低檢測(cè)成本。

而普通無(wú)紡布、聚酯纖維與尼龍布濾袋NDF測(cè)定值均顯著低于ANKOM F58濾袋，這與袁翠林等[10]和張崇玉等[11]研究結(jié)果不一致。究其原因，一是可能與試驗(yàn)樣品粉碎細(xì)度不同有關(guān)。袁翠林等[10]和張崇玉等[11]的試驗(yàn)樣品粉碎細(xì)度為18目，而本試驗(yàn)樣品粉碎細(xì)度為40目。二是與濾袋材質(zhì)和孔徑有關(guān)。與400目尼龍布濾袋[10]和460目聚酯纖維濾袋[11]比較，ANKOM F58濾袋孔徑更小，且具備三維結(jié)構(gòu)，在暢通洗滌液出入濾袋膜、確保洗滌充分的同時(shí)，能更有效阻止樣品細(xì)小微粒的流失。本試驗(yàn)用連續(xù)法測(cè)定樣品ADF含量過(guò)程中，聚酯布和尼龍布濾袋破損現(xiàn)象普遍，均是封口內(nèi)緣斷裂，導(dǎo)致ADF含量偏低。這可能與本試驗(yàn)的濾袋縫制和封口方法有關(guān)，表明熱封口方法不適合聚酯布和尼龍布濾袋制作。聚酯纖維與尼龍布濾袋在NDF和ADF測(cè)定中的應(yīng)用還有待于對(duì)縫制方法、孔徑大小及適宜樣品粉碎細(xì)度上做進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

隨著樣品粉碎細(xì)度的增加，NDF和ADF含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。用孔徑為10 μm的特制三維無(wú)紡布纖維濾袋測(cè)定飼草中NDF和ADF含量時(shí)，樣品適宜粉碎細(xì)度為18～40目，但為與粗蛋白等其他養(yǎng)分指標(biāo)測(cè)定時(shí)保持一致的粉碎細(xì)度，建議粉碎細(xì)度為40目。

利用CAU濾袋測(cè)定樣品NDF和ADF含量與ANKOM F58濾袋差異不顯著，可在濾袋法測(cè)定飼草NDF和ADF含量中替代應(yīng)用。聚酯布和尼龍布濾袋在ADF測(cè)定過(guò)程中易出現(xiàn)破損現(xiàn)象，其在NDF和ADF測(cè)定中的應(yīng)用還有待于對(duì)縫制方法、孔徑大小及適宜樣品粉碎細(xì)度方面做進(jìn)一步研究。