熒光染色、PAS染色和美藍(lán)染色在馬拉色菌毛囊炎診斷中的比較

鐘白玉，徐 艷，鄧向芬，張 靜，高 星，宋志強，翟志芳

馬拉色菌為馬拉色菌毛囊炎的病原菌，在臨床檢測中一般用KOH涂片直接鏡檢常因圓形均質(zhì)的暗綠色反光顆粒的脂肪滴與馬拉色菌菌體極其相似而混淆，難以獲得滿意效果。本研究對100份馬拉色菌毛囊炎患者臨床標(biāo)本分別采取真菌熒光染色、過碘酸雪夫染色（PAS）和美藍(lán)染色進(jìn)行染色效果及陽性率比較，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 病例來源

收集2017年6月～8月皮膚科門診擬診為馬拉色菌毛囊炎患者100例?；颊吣挲g13～45歲，男72例，女28例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：擬診為馬拉色菌毛囊炎；皮損多發(fā)；無明顯膿皰、糜爛滲出等；同意進(jìn)行該項檢查者。

1.2 染色液（試劑）

溯康?真菌熒光染色液（南京漢瑞生物科技有限公司生產(chǎn)，重慶林?？滇t(yī)療器械有限公司提供，批準(zhǔn)文號：蘇寧械備20160022號）；PAS染色試劑：按王端禮主編《醫(yī)學(xué)真菌學(xué)-實驗室檢驗指南》的配方配制[1]；美藍(lán)染色液：按葉順章和張木有主編的《性傳播疾病實驗診斷手冊》的配方配制[2]。

1.3 取材及染色方法

主要選擇胸背部和面頸部基本一致的紅色丘疹進(jìn)行取材，取其丘疹內(nèi)容物或皮屑，每例患者取3份標(biāo)本分別用于3種染色。以75%乙醇消毒皮損表面，用拔毛鑷或鈍手術(shù)刀片刮取病變皮屑或擠出有白色膿頭的丘疹內(nèi)容物，分別涂布于3張潔凈的載玻片上備用。分別以熒光顯微鏡或普通光學(xué)顯微鏡在中低倍鏡下尋找視野中的可疑的染色陽性菌體，再以高倍鏡證實并記錄。

1.3.1 熒光染色法 在涂布標(biāo)本的載玻片上滴加1滴溯康?真菌熒光染色液，蓋上蓋玻片使染色液與標(biāo)本充分結(jié)合，輕壓蓋玻片并吸去蓋玻片周邊多余染色液，數(shù)秒鐘后于熒光顯微鏡下觀察和記錄。

1.3.2 PAS染色法 已涂布標(biāo)本載玻片置于95%乙醇中固定1 min，水洗后再將載玻片浸于1%過碘酸溶液中氧化5 min后水洗，把載玻片放于雪夫試劑中染色5 min后水洗，再以偏亞硫酸鈉溶液浸泡1 min后，水洗，自然涼干，滴加1滴香柏油置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.3 美藍(lán)染色法 在涂布標(biāo)本的載玻片上滴加1滴美藍(lán)染色液染1～2 min水洗，自然涼干，滴加1滴香柏油置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

經(jīng)真菌熒光染色后，可見圓形或葫蘆形的酵母孢子呈亮綠色熒光,背景反差較大，圖像清晰，皮屑呈淺藍(lán)色,而其他成分（如脂滴、氣泡）不著色；②經(jīng)PAS染色后，高倍鏡下可見孢子染成深玫瑰紅色，較為清晰，角質(zhì)細(xì)胞呈淡紅色；③經(jīng)美藍(lán)染色后，可見圓形、出芽成葫蘆形的紫紅色酵母孢子，較為清晰，脂滴、氣泡等背景中的雜質(zhì)不著色，皮屑亦染成深藍(lán)色（圖1）。3種染色方法的陽性率比較見表1。

表1 3種染色方法在馬拉色菌毛囊炎診斷中的陽性率比較 [例數(shù)(%)]

3 討論

圖1 不同染色方法檢測馬拉色菌鏡下所見

馬拉色菌為健康人皮膚正常寄生菌群之一，但與馬拉色菌毛囊炎、頭皮屑過多、脂溢性皮炎、銀屑病、痤瘡等有關(guān)。臨床中，常規(guī)KOH涂片檢測方法對于馬拉色菌的檢測敏感度并不能很好滿足臨床要求。筆者對目前應(yīng)用于臨床的真菌熒光染色、PAS染色及美藍(lán)染色3種檢測方法進(jìn)行了比較分析，三者各有其優(yōu)缺點。首先，真菌熒光染色液可用于人體組織或樣本的染色處理，包括皮屑、甲屑、毛發(fā)、尿液、體液及陰道分泌物等，在熒光顯微鏡下定性檢測真菌。主要原理是熒光增白劑與組織中可能存在的真菌細(xì)胞壁β-多糖結(jié)合，如幾丁質(zhì)和纖維素等，在紫外光的激活下，可使真菌顯示出熒光。通過250～400 nm濾鏡的熒光顯微鏡下觀察，判斷真菌的存在，即使僅有少量的菌體，也能迅速捕獲，大大節(jié)省了檢測時間，并提高了陽性率。PAS染色為傳統(tǒng)的多糖成分染色法，是利用過碘酸作為氧化劑，將多糖的葡萄糖分子的兩個相鄰帶有羥基的-C-C-鍵打開，生成醛基再與染色劑結(jié)合。雪夫試劑中的堿性品紅為一種混合物，經(jīng)過亞硫酸和二氧化硫的作用，醌式結(jié)構(gòu)的雙鍵被破壞而消失形成無色復(fù)紅，再經(jīng)氧化后醛基與無色復(fù)紅液進(jìn)行結(jié)合呈紫紅色，菌體染色成紫紅而清晰可見。美藍(lán)作為一種細(xì)胞染色劑，其染色方法是利用美藍(lán)染料對組織蛋白、菌體（多糖成分）有異染性，在配制時若加微量10% KOH溶液即成堿性美藍(lán)染色液，染色過程中使皮屑標(biāo)本充分溶解，以便菌體與染色液較好結(jié)合，菌體染色呈深藍(lán)色，而背景僅著淡藍(lán)色，增加了對比度，提高了分辨力。

經(jīng)比較研究表明，3種染色方法對馬拉色菌均具有很高的陽性檢出率，且其檢測陽性率相接近。但三者相比較，真菌熒光染色法簡便快捷，僅需1滴染色液立即壓片即可熒光顯微鏡觀察，而且鏡下背景反差較大，圖像清晰，相比于PAS和美藍(lán)染色法更易于觀察，省時省力。但真菌熒光染色法成本相對較高，需要在熒光顯微鏡下觀察，限制了其臨床的廣泛使用。PAS染色法菌體被染成玫瑰紅色，結(jié)締組織染成淺紅色，菌體較易于識別，但其操作相對繁鎖、費時，且陽性率略低于另外兩種方法。相對于前二者而言，美藍(lán)染色法的菌體染成紫紅色，易與脂滴、細(xì)胞間隙相鑒別，而且該方法操作簡便，對于初學(xué)者易于常握，適用于臨床廣泛應(yīng)用。