IL-23R基因多態(tài)性與寧夏地區(qū)銀屑病易感性的研究

楊兵艷，扈容英，董靈娣，喻 楠，高永龍，寇 樂(lè)

銀屑?。╬soriasis）是一種常見(jiàn)的T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性復(fù)發(fā)性以遺傳為背景的皮膚病[1]。遺傳流行病學(xué)已證實(shí)銀屑病具有顯著遺傳性，許多研究提示白細(xì)胞介素（IL）-23R基因多態(tài)性與銀屑病發(fā)病密切相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)IL-23R基因多態(tài)性與銀屑病的研究主要集中在南方地區(qū)及漢族人群，北方地區(qū)及不同種族的相關(guān)研究資料相對(duì)較少。因此，筆者收集101例寧夏地區(qū)尋常性銀屑病患者和103例正常對(duì)照，選擇在歐美及中國(guó)南方漢族人群中發(fā)現(xiàn)的易感位點(diǎn)即IL-23R 基因的5個(gè)SNP位點(diǎn)（rs11209032，rs1343151，rs10489629，rs10889677，rs1495965），應(yīng)用TaqMan探針熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)對(duì)其進(jìn)行基因分型，以進(jìn)一步探討寧夏地區(qū)人群中IL-23R基因多態(tài)性與尋常性銀屑病的易感性關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2016年4 月—2017年4月前來(lái)我院皮膚科門診及住院部就診的寧夏地區(qū)尋常性銀屑病患者101例，這些患者均被2名副主任醫(yī)師以上皮膚科醫(yī)生確診，均與尋常性銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)相符[1]。其中男69例，女32例，平均年齡（34.81±16.98）歲。正常對(duì)照組103例，其中男61例，女42 例，平均年齡（34.15±16.06）歲。正常對(duì)照均來(lái)自我院體檢中心的健康人或我院健康職工，同時(shí)要求對(duì)照組中一～三級(jí)親屬中未患銀屑病。兩組間性別（χ2=1.824，P＞0.05）和年齡（t=0.284，P＞0.05）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料和全血標(biāo)本的采集 由經(jīng)過(guò)專門培訓(xùn)的流行病學(xué)調(diào)查員，采用統(tǒng)一設(shè)計(jì)的尋常性銀屑病調(diào)查表，對(duì)患者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查。所有受試者均為寧夏地區(qū)人群，彼此間無(wú)血緣關(guān)系。向研究對(duì)象充分告知本次研究的目的和意義，并簽署知情同意書。知情同意書由寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審議批準(zhǔn)。用5 ml的EDTA抗凝管采取受試者外周靜脈血3～4 ml，存放于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外周血基因組DNA提取 將血標(biāo)本解凍后，嚴(yán)格按照天根血液基因組DNA提取試劑盒相應(yīng)操作步驟對(duì)204份樣本外周血DNA進(jìn)行提取，測(cè)定每份樣本DNA濃度及純度，并詳細(xì)記錄，符合標(biāo)準(zhǔn)的離心后存放于-20℃冰箱中備用。

1.2.3 SNP位點(diǎn)的選取 登陸NCBI網(wǎng)站的Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢已公布的1號(hào)染色體上IL-23R基因的序列，選取5個(gè)已知的并且已證實(shí)與銀屑病易感性相關(guān)的SNP位點(diǎn)（rs11209032，rs1343151，rs10489629，rs10889677，rs1495965）。

1.2.4 TaqMan探針熒光PCR進(jìn)行SNP的基因分型 采用TaqMan SNP基因分型試劑盒(美國(guó)ABI公司)對(duì)IL-23R基因5個(gè)SNP位點(diǎn)（rs11209032，rs1343151，rs10489629，rs10889677，rs1495965）進(jìn)行基因分型。TaqMan熒光探針由ABI公司設(shè)計(jì)并合成。按照試劑盒的要求規(guī)范操作，配10 μl的PCR體系用羅氏480的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

依據(jù)哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium）檢驗(yàn)判斷樣本是否具有群體代表性，將SNP的等位基因及單體型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析、遺傳連鎖不平 衡（linkage disequilibrium，LD） 分 析， 應(yīng) 用Haploview4.2軟件[2]進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、LD分析和每個(gè)位點(diǎn)在患者組、對(duì)照組中等位基因頻率和單體型頻率差異的卡方檢驗(yàn)。在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析之前，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行整理，分別整理成該軟件識(shí)別的文件格式類型即.ped文件和.info文件。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

Position表示IL-23R基因的5個(gè)SNP位點(diǎn)（rs11209032，rs1343151，rs10489629，rs10889677，rs1495965）分別在1號(hào)染色體上的位置，5個(gè)SNP位點(diǎn)在正常對(duì)照組中的觀察值和期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），表明本研究數(shù)據(jù)符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，樣本具有群體代表性（表1）。

2.2 IL-23R基因5個(gè)SNP位點(diǎn)與尋常性銀屑病關(guān)聯(lián)分析

Haploview4.2軟件分析發(fā)現(xiàn)，患者組和對(duì)照組間IL-23R基因5個(gè)SNP位點(diǎn)等位基因頻率分布無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；颊呓M和對(duì)照組中rs10489629位點(diǎn)的A等位基因頻率分別為2.607和2.323，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.280，P=0.597）；患者組和對(duì)照組中rs1343151位點(diǎn)的C等位基因頻率分別為32.667和21.889，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.563，P=0.453）；患者組和對(duì)照組中rs10889677位點(diǎn)的C等位基因頻率分別為2.258和2.121，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.086，P=0.769）；患者組和對(duì)照組中rs11209032位點(diǎn)的G等位基因頻率分別為0.853和0.761，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.332，P=0.565）；患者組和對(duì)照組中rs149565位點(diǎn)的G等位基因頻率分別為0.924和0.873，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.082，P=0.774）。故認(rèn)為IL-23R基因這5個(gè)SNP位點(diǎn)與寧夏地區(qū)尋常性銀屑病遺傳易感性無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）（表2）。

2.3 LD分析、單體型的構(gòu)建及其與尋常性銀屑病遺傳易感性的關(guān)系

整理后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在Haploview4.2軟件下運(yùn)行，可直接顯示出IL-23R基因的5個(gè)位點(diǎn)中rs11209032和rs1495965這兩個(gè)位點(diǎn)之間存在LD（D'=0.957，r2=0.821）。r2值越大（r2＞ 0.08），D'越接近 1，越容易出現(xiàn)LD。rs11209032和rs1495965構(gòu)建的單體型分別為AA、GG、AG、GA（圖1）。對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析發(fā)現(xiàn) （表3），患者組和對(duì)照組中單體型AA的頻率分別為1.059和1.079，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.09，P=0.926）；患者組和對(duì)照組中單體型GG的頻率分別為0.835和0.716，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.596，P=0.440）；患者組和對(duì)照組中單體型AG的頻率分別為0.026和0.052，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=1.605，P=0.205）；患者和對(duì)照組中單體型GA的頻率分別為0.006和0.015，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.921，P=0.337）；故rs11209032和rs1495965構(gòu)建的單體型與寧夏地區(qū)尋常性銀屑病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

注：SNP：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性：P＞0.05時(shí)，基因型頻率的總體分布符合Hardy-Weinberg平衡定律

表2 IL-23R基因SNPs位點(diǎn)等位基因與尋常性銀屑病的關(guān)聯(lián)分析

圖1 IL-23R基因SNPs的LD圖

表3 IL-23R基因單倍型與尋常性銀屑病的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

銀屑病是一種T淋巴細(xì)胞異?；罨徒?rùn)為主的以紅斑鱗屑為基本表現(xiàn)的慢性炎癥性皮膚病，銀屑病在人群中的發(fā)病率為1%～3%。該病與遺傳有關(guān)，具有遺傳異質(zhì)性和種族差異性。目前普遍認(rèn)為，銀屑病是一種由多基因控制和環(huán)境因素共同影響的復(fù)雜免疫失衡性皮膚病[1]。

IL-23R（位于1號(hào)染色體上，其表達(dá)IL-23受體，參與T淋巴細(xì)胞分化）和IL-12B（位于5號(hào)染色體上，其表達(dá)IL-12B）是兩大主要的免疫系統(tǒng)基因，均與銀屑病發(fā)病強(qiáng)相關(guān)。T淋巴細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致銀屑病[3]。IL- 23R在記憶T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞均有表達(dá)，Jak家族中的Tyk2和Jak2可分別與IL-12Rβ1和 IL-23R結(jié)合。IL-23分子與受體結(jié)合后激活下游Jaks分子，使受體胞內(nèi)區(qū)的stat3結(jié)合位點(diǎn)磷酸化，并使stat3二聚體磷酸化，磷酸化后stats二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，從而誘導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[4]。已有研究證實(shí)，在銀屑病皮損可發(fā)現(xiàn)stat3蛋白的過(guò)表達(dá)[5]，也有研究顯示IL-23細(xì)胞因子存在于銀屑病患者外周血中[6]。這些研究均提示IL-23R與銀屑病發(fā)病相關(guān)。

SNP是基因組內(nèi)由單個(gè)核苷酸發(fā)生變異引起的DNA堿基排列序列的變化，這種變化影響基因功能，從而使個(gè)體增加或減少對(duì)疾病的易感性。近年來(lái)，IL-23R基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與銀屑病的相關(guān)性已在全基因組關(guān)聯(lián)研究和相關(guān)的重復(fù)性研究中得到證實(shí)。Cargill等[7]在北美白種人群中對(duì)1 446例銀屑病患者和1 432例正常對(duì)照組進(jìn)行了病例對(duì)照研究，研究顯示銀屑病與SNP rs3212227、rs6887695 易感性具有強(qiáng)相關(guān)性，并且這種結(jié)果在小樣本量的日本人群中得到證實(shí)。Capon等[8]在歐洲人群中對(duì)IL- 23R基因進(jìn)行遺傳性研究顯示，IL- 23R/p40SNPs rs10045431、rs3212227與銀屑病具有相關(guān)性。李珊珊等[9]研究表明，IL-23R基因SNP的1個(gè)位點(diǎn)rs376218與漢族人銀屑病的易感性相關(guān)。羅權(quán)等[10]研究了國(guó)內(nèi)漢族人群銀屑病與IL-23R基因的4個(gè)SNPs位點(diǎn)（rs1343151，rs1004819，rs10889677，rs1495965）有顯著相關(guān)性。這些關(guān)于IL- 23R基因多態(tài)性與銀屑病相關(guān)性研究為銀屑病的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。

我國(guó)有關(guān)IL-23R基因多態(tài)性與銀屑病的研究主要集中在南方地區(qū)及漢族人群，分別對(duì)其進(jìn)行過(guò)大樣本研究[9-11]。而北方地區(qū)及不同種族的相關(guān)研究資料相對(duì)較少。韓建文等[12]曾對(duì)中國(guó)北方漢族尋常性銀屑病與基因多態(tài)性做過(guò)關(guān)聯(lián)性研究分析，但I(xiàn)L-23R基因多態(tài)性與銀屑病的關(guān)聯(lián)分析北方地區(qū)少見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在寧夏地區(qū)人群中通過(guò)病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)IL-23R基因的rs11209032、rs10489629位點(diǎn)與銀屑病易感性不相關(guān)，這與之前羅權(quán)等[10]的報(bào)道是吻合的，同時(shí)該學(xué)者研究證明IL-23R基因的這5個(gè)SNPs位點(diǎn)中有3個(gè)SNPs位點(diǎn)（rs1343151、rs10889677、rs1495965）與銀屑病具有明顯相關(guān)性（P＜0.01）。而筆者的研究中并未發(fā)現(xiàn)這3個(gè)位點(diǎn)與銀屑病易感性相關(guān)，因此進(jìn)一步做了LD分析，發(fā)現(xiàn)rs11209032和rs1495965位點(diǎn)之間有一定的LD（D'=0.957，r2=0.821），對(duì)這2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析，但仍未發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

雖然在本實(shí)驗(yàn)中并未發(fā)現(xiàn)IL-23R基因5個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因與尋常性銀屑病易感性相關(guān)，但相關(guān)研究顯示IL-23R基因多態(tài)性與北美、高加索人以及漢族人銀屑病易感性顯著相關(guān)[7-11]，故并不能認(rèn)為IL-23R基因與銀屑病易感性不相關(guān)。在歐美人群中研究發(fā)現(xiàn)IL-23R基因的SNPs（rs11209026、rs2201841、rs7530511）等位基因與銀屑病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[13,14]。然而這種相關(guān)性并沒(méi)有在大樣本的漢族人群得到驗(yàn)證[15]。IL-23R 基因的另一個(gè) SNP rs2201841，在漢族人群中的最小等位基因?yàn)?A，而在歐美人群是G[6]，這種最小等位基因的不同也是人群差異性的一個(gè)反映。由此可見(jiàn)，IL-23R區(qū)域的SNP信號(hào)在不同的人群中存在異質(zhì)性。在中國(guó)南方人群中發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性位點(diǎn)，可能由于SNP頻率的不同，環(huán)境因素、生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣的差異，也由于各家研究的設(shè)計(jì)方法、入選標(biāo)準(zhǔn)不一，以及樣本量小，統(tǒng)計(jì)方法不一，導(dǎo)致結(jié)果不盡一致，從而引起IL-23R基因某些位點(diǎn)與寧夏地區(qū)人群銀屑病易感性無(wú)相關(guān)性。因此，在探究IL-23R基因多態(tài)性與銀屑病的相關(guān)性時(shí)，嚴(yán)格設(shè)計(jì)、選擇多中心的大樣本，檢測(cè)覆蓋更多不同基因區(qū)域的SNP是非常必要的。希望這種遺傳異質(zhì)性的揭示，為研究不同地區(qū)不同種族銀屑病與IL-23R基因多態(tài)性提供新的遺傳線索。