復合酶法優(yōu)化川牛膝多糖提取工藝研究

葉秀娟 黃穎賢 李少鳳

川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula officinalis Kuan的干燥根[1-3]，其性平，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，具有逐瘀通經(jīng)、通利關節(jié)、利尿通淋的功效，主要分布于四川、貴州、云南等地區(qū)。川牛膝含有的水溶性物質(zhì)——多糖[4-5]為活性物質(zhì)，其具有增強免疫力，抑制腫瘤轉移、保護肝臟、升高白細胞的功能，常用于免疫調(diào)節(jié)和腫瘤治療等，因此對川牛膝多糖的研究有較高的應用價值。研究川牛膝多糖首先需要將多糖最大限度的提取出來，近年來對川牛膝多糖的常規(guī)提取研究主要集中在水煮法、超聲法等，已有的常規(guī)方法具有損失大、工序多、周期長、提取率低等缺點，因此迫切需要開發(fā)新的提取方法為工業(yè)大規(guī)模提取多糖提供技術上的支持。酶在適當?shù)臈l件下具有一定的活性，尤其是纖維素酶對植物細胞壁有很好的作用。本研究旨在用正交試驗復合酶法[6]優(yōu)化川牛膝多糖的提取工藝，為工業(yè)大規(guī)模提取提供技術支持和后期研究川牛膝多糖奠定理論基礎，現(xiàn)報道如下。

1 材料、儀器與試驗材料

川牛膝（安徽亳州生產(chǎn)，批號：20170920）；中草藥粉碎機（許昌市豫邦機械制造有限公司生產(chǎn)，型號：ZY-C350）；紫外分光光度計（濟南思泉醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)，型號：TU-1810）；恒溫磁力攪拌器[珩衍謹誠（北京）科技有限公司生產(chǎn)，型號：85-2]；高速離心機（賽默飛生產(chǎn)，型號：賽Sorvall LYNX4000）；電子天平（賽多利斯生產(chǎn)，型號：BSA224S）；旋轉蒸發(fā)儀（上海越眾儀器設備有限公司生產(chǎn)，型號：R201D）；pH計（賽多利斯生產(chǎn)，型號：PB-21）；蒸餾水（屈臣氏生產(chǎn)）；葡萄糖（天津市凱通化學試劑有限公司生產(chǎn)，分析純）；苯酚、濃硫酸（國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，分析純）；乙醇（OMNI生產(chǎn)，分析純）；纖維素酶（酶活力≥400 U/mg，批號：20171213）、蛋白酶（酶活力≥100 U/mg，批號：20180324）、果膠酶（酶活力≥500 U/mg，大連美倫生物技術有限公司生產(chǎn)，批號：20171120）。

2 方法與結果

2.1 多糖提取流程取干燥的川牛膝→粉碎→篩分→稱取→提取→調(diào)節(jié) pH值→復合酶提取→滅酶→抽濾→減壓濃縮→醇沉過夜→離心分離→沉淀復溶→粗多糖溶液。

2.2 操作要點將川牛膝用粉碎機粉碎后過 80目篩，備用。稱取約10 g川牛膝粉末，按料液比加入蒸餾水，提?。惶崛『蠹尤刖彌_液并用酸度計調(diào)節(jié)pH值，按纖維素酶:果膠酶:蛋白酶=1:1:1加入一定質(zhì)量的復合酶，于恒溫磁力攪拌器上恒溫提取60 min后，90℃滅酶 10 min；真空抽濾機抽濾，取濾液，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至30～50 ml，向濃縮液中加入3倍體積分數(shù)為95%的乙醇，4℃條件下醇沉過夜；4000 r/min離心15 min后收集沉淀，加入蒸餾水復溶，即得出多糖溶液。

2.3 川牛膝多糖含量測定

2.3.1 葡萄糖標準曲線繪制精密稱取葡萄糖對照品20.00 mg至100 ml容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋定容至刻度，搖勻后即得濃度為0.2 mg/ml的葡萄糖對照品儲備液。分別量取對照品儲備液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml、6.0 ml、7.0 ml置于 50 ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。按照苯酚-硫酸法顯色，在490 nm下紫外掃描測定吸光度，記錄葡萄糖濃度（X）相應的吸光度（Y），并繪制標準曲線，得標準曲線為：Y=11.125X+0.0281（r=1.000）,在0.008～0.056 mg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好（圖1）。

圖1 葡萄糖標準曲線圖

2.3.2 含量測定取川牛膝多糖溶液適量，于50 ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋，定容至刻度，搖勻。按照苯酚-硫酸法顯色，在490 nm下紫外掃描測定吸光度，帶入2.3.1項下的線性方程計算濃度，進而推算多糖含量。計算公式：多糖得率=nCV0/（100 m）×100%。針對公式特殊說明：C為提取的川牛膝多糖樣品液的質(zhì)量濃度（mg/ml）；n為稀釋倍數(shù)；V0為川牛膝多糖樣品液的總體積（ml）；m為稱取的預處理的川牛膝粉的質(zhì)量（g）。

2.4 正交試驗

2.4.1 優(yōu)化川牛膝多糖提取工藝在預實驗單因素考察的基礎上，用正交試驗對復合酶法提取川牛膝多糖進行優(yōu)化，選取料液比（g/ml）、復合酶（纖維素酶:果膠酶:蛋白酶=1:1:1）用量（%）、pH 值、溫度（℃）4個對結果影響較大的因素，在3水平上用多糖含量作為評價指標設計正交試驗L9（34），因素水平設計如表1。

表1 正交試驗主要因素與水平表

表2 復合酶法優(yōu)化川牛膝多糖提取工藝正交試驗結果

由表2結果直觀分析可得，以多糖含量為考察指標，四個因素影響程度依次為 C＞B＞D＞A，且A1＞A2＞A3、B2＞B3＞B1、C3＞C2＞C1、D2＞D1＞D3可以得出，最佳工藝條件為A1B2C3D2。

表3 復合酶法優(yōu)化川牛膝多糖提取工藝方差分析表

由表3方差分析可得，以多糖含量為考察指標時，因素C對試驗結果有顯著性影響，因素A、B和D對實驗結果均無顯著性影響，因此最佳制備工藝為A1B2C3D2，即料液比為 1:20（g/ml）、復合酶用量為0.7%、pH值為6.0、溫度為45℃為最佳工藝條件。

2.4.2 驗證性試驗通過正交試驗確定最佳制備工藝條件，并進行驗證實驗。按照計算出的多糖含量計算相對標準偏差來分析最佳公工藝條件是否穩(wěn)定。平行制備6份，結果見表6。

表4 驗證試驗結果

結果顯示，相對標準偏差（RSD）為0.09%，得出復合酶法優(yōu)化川牛膝多糖提取方案的重現(xiàn)性較好，說明最佳提取工藝條件穩(wěn)定可行。

3 討論

通過正交試驗[7-9]對復合酶法提取川牛膝多糖工藝進行篩選，得出最佳的提取方案為料液比為1:20（g/ml）、復合酶用量為0.7%、pH值為6.0、溫度為 45℃。在最佳方案的基礎上對該方法進行驗證性試驗，驗證結果具有較好的重現(xiàn)性，該方法可行，可用于川牛膝多糖工業(yè)上的大規(guī)模提取。在確定葡萄糖測定的最大紫外吸收波長時，筆者從配制一定濃度的對照品溶液顯色后在190～800 nm進行波長掃描，發(fā)現(xiàn)在490 nm處有較大的吸收，故確定490 nm為最大紫外吸收波長。本研究采用的復合酶可以將細胞壁溶解，能最大限度地增加多糖得率。酶[10]的活性容易受到溫度、pH值等因素的影響，故將溫度、pH值[11]作為正交試驗的因素。預實驗過程中先將其余 3個因素固定，只改變剩余的一個因素，考察這一因素在不同條件下的多糖得率，得出最佳的結果，其他單因素考察以此類推。

近年來，對于復合酶法提取藥材中多糖的研究屢見不鮮，比如復合酶法提取白術多糖、枸杞多糖、海帶多糖[12-14]等，可見復合酶法應用廣泛。本研究也進一步證明復合酶法提取多糖可靠，易行。筆者研究復合酶法優(yōu)化川牛膝多糖的最佳提取工藝為后續(xù)研究多糖活性奠定了物質(zhì)基礎。