非綜合征型聾患者及家庭成員耳聾基因MYO15A檢測(cè)及其產(chǎn)前診斷意義*

柴福 趙海亮 李勝 林晉業(yè) 魏建芳 邱書奇

在遺傳性耳聾中，70%為非綜合征型感音神經(jīng)性聾(nonsyndromic sensorineural hearingloss,NSHL)，30%為綜合征型聾[1]。到目前為止,已報(bào)道的耳聾基因位點(diǎn)已超過100個(gè)，已鑒定出70多個(gè)非綜合征型耳聾位點(diǎn)[2]。最常見的NSHL致病基因按出現(xiàn)的頻率依次為GJB2、SLC26A4、MYO15A、 OTOF和CDH23[3]。國(guó)外有研究表明伊朗先天性重度聾患者中MYO15A突變率約為5.71%，在土耳其則為9.9%，這些研究表明MYO15A基因突變是導(dǎo)致耳聾相對(duì)重要的原因[4,5]。國(guó)內(nèi)報(bào)道集中于人類常見的耳聾基因GJB2、SLC26A4和線粒體基因12SrRNA突變，而且依靠基因特異性的Sanger基因測(cè)序方法檢測(cè)。MYO15A基因突變是全球最常見的NSHL致病因素之一，由于基因尺寸大，且在大多數(shù)種族人群中的突變頻率和頻譜未知，導(dǎo)致MYO15A基因的診斷用常規(guī)的方法難以實(shí)現(xiàn)。

芯片捕獲高通量測(cè)序(targeted genomic capturing and next-generation sequencing，targeted DNA-Hiseq)可以快速、高效地分析人類疾病的致病基因突變[2]，本研究擬運(yùn)用芯片捕獲高通量測(cè)序，對(duì)2個(gè)漢族雙親正常的NSHL聾兒及家庭成員進(jìn)行127個(gè)耳聾基因編碼區(qū)及鄰近剪切區(qū)的DNA測(cè)序，并對(duì)其中一個(gè)家庭的高危胎兒進(jìn)行了孕中期的產(chǎn)前診斷，以探討NSHL患者及家庭成員耳聾基因MYO15A的突變位點(diǎn)及該基因檢測(cè)分析用于產(chǎn)前診斷的可行性。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 2016年11月和2016年12月就診于深圳市龍崗區(qū)耳鼻咽喉醫(yī)院耳科門診的2個(gè)NSHL患兒及家庭成員(編號(hào)為NSHL-01和NSHL-02)。2個(gè)家庭無親緣關(guān)系，患兒父母親均表型正常，非近親結(jié)婚。本研究經(jīng)深圳市耳鼻咽喉研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有基因診斷和產(chǎn)前基因診斷工作均取得患者及家屬的同意并簽署知情同意書。

NSHL-01： 病例1,男， 2歲8月，足月順產(chǎn)，其父母聽力正常且無身體其它部位異常，家族中無類似耳聾患者，無耳毒性藥物使用史。耳部檢查：耳廓及外耳道發(fā)育正常，鼓膜未見異常；發(fā)育及智力正常，無其它既往疾病史；40 Hz相關(guān)電位和聽性腦干反應(yīng)(ABR)未引出波形，顳骨CT未發(fā)現(xiàn)異常；臨床診斷為非綜合征型感音神經(jīng)性聾(NSHL)，并已為患兒行人工耳蝸植入術(shù)。

NSHL-02：病例2，男，3歲6個(gè)月，足月順產(chǎn)，生長(zhǎng)發(fā)育史正常。其父母聽力正常且無其它異常，家族中無類似耳聾患者，無耳毒性藥物使用史。出生后聽力篩查未通過，確診為雙側(cè)對(duì)稱性中度感音神經(jīng)性聾；10月齡開始佩戴助聽器，語言發(fā)育好。耳部檢查：雙耳廓及耳道發(fā)育正常，鼓膜正常，發(fā)育及智力正常，身體其它部位無異常?；純?歲時(shí)雙側(cè)行為測(cè)聽0.5、1、2、4 kHz氣導(dǎo)平均聽閾為55 dB HL, 顳骨CT未發(fā)現(xiàn)異常。臨床診斷為非綜合征型感音神經(jīng)性聾(NSHL)；患兒母親已再次妊娠。

1.2研究方法

1.2.1基因組DNA的提取 簽署知情同意書后，抽取患兒及其家庭成員外周靜脈血各2 ml，含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetracetic acid EDTA)的抗凝管保存?zhèn)溆?。?yīng)用我國(guó)TIANGEN BIOTECH公司 Blood DNA提取試劑盒提取樣本DNA，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。NSHL-02家庭母親妊娠18周時(shí)，超聲引導(dǎo)下經(jīng)腹抽取胎兒羊水10 ml,進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。

1.2.2目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序 應(yīng)用已知遺傳性聾基因捕獲試劑盒，對(duì)遺傳性聾基因編碼區(qū)及臨近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集，靶向的基因見表1;具體方法：樣本準(zhǔn)備及外顯子捕獲，建立測(cè)序文庫(kù)：準(zhǔn)備3-5耳聾基因組DNA,用自適應(yīng)高聚焦超聲技術(shù)，將基因組DNA隨機(jī)打成200～300 bp的片段，打斷的DNA進(jìn)行修復(fù)，末端加堿基A，并接上接頭；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，建立測(cè)序文庫(kù)；擴(kuò)增后進(jìn)行磁珠純化，制備雜交文庫(kù)；文庫(kù)鑒定合格后的DNA片段與GenCap耳聾基因捕獲試劑盒(GenCap DeafPanel)進(jìn)行雜交，包含127個(gè)耳聾基因和線粒體基因，這個(gè)芯片能夠捕獲所有外顯子和兩側(cè)的內(nèi)含子(10 db)序列。將經(jīng)過富集的測(cè)序區(qū)域DNA洗脫下來，PCR擴(kuò)增建成測(cè)序文庫(kù)。

表1 不同類型耳聾檢測(cè)的靶向基因

1.2.3Hiseq2000高通量測(cè)序生成成對(duì)的reads(PE90)[1]采用illlumina Hiseq2000高通量測(cè)序系統(tǒng)，主要通過把含有耳聾目標(biāo)基因DNA的隨機(jī)片段雜交到含有接頭的探針上，對(duì)富集到耳聾基因的DNA片段，通過延長(zhǎng)與橋梁擴(kuò)增，用4種末端被封閉的、由不同熒光素標(biāo)記的堿基進(jìn)行邊合成邊測(cè)序，此過程覆蓋了目標(biāo)序列堿基>98%的區(qū)域，對(duì)堿基位置的檢測(cè)準(zhǔn)確度>99%,平均深度不小于200X(本實(shí)驗(yàn)在深圳華大基因完成)。

1.2.4數(shù)據(jù)分析及突變命名 對(duì)檢測(cè)到的堿基變異在NCBIdbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)和1000基因組數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行分析，排除已知多態(tài)性位點(diǎn)。通過檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)Human Gene Mutation Datebase(HGMD,http：//www.hgmd.org/)和Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)(http：www.cnbi.nlm.nih.gov/pubmed/)來明確變異是否為已知致病突變；用Mutation Tater、SIFT和Polyphen軟件對(duì)新變異進(jìn)行蛋白功能預(yù)測(cè)，并對(duì)200例健康無關(guān)個(gè)體測(cè)序以排除多態(tài)性位點(diǎn)。新突變的命名參照國(guó)際基因變異命名體制(http：//www.hgvs.org/mutnomen)提供的命名法來命名。

1.2.5桑格(sanger)測(cè)序 使用sanger測(cè)序?qū)Π瑵撛谕蛔兊腄NA序列進(jìn)行分析來確認(rèn)該變異,即使用家系成員的基因組DNA進(jìn)行驗(yàn)證，本研究2個(gè)家庭均有父母的基因組DNA進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6胎兒產(chǎn)前診斷 NSHL-02家系中先證者的致病基因變異明確后，其母親孕18周時(shí)采集胎兒羊水標(biāo)本行產(chǎn)前診斷，提取DNA并用桑格測(cè)序法對(duì)胎兒進(jìn)行該基因變異分析。用ADI基因測(cè)序儀進(jìn)行DNA片段分析，需排除母體污染，排除方法：運(yùn)用美國(guó)Gene Napper V3.2軟件，污染標(biāo)準(zhǔn)：胎兒各等位基因位點(diǎn)螢光峰分別來自父母，胎兒各位點(diǎn)無來自母親的第二熒光峰。

2 結(jié)果

2.1MYO15A基因(參考序列NM-016239)突變檢測(cè)結(jié)果 病例1及家庭成員(NSHL-01)：患兒檢出MYO15A基因內(nèi)含子18亞區(qū)c.5134-1G>A雜合突變和外顯子20亞區(qū)c.5324A>C雜合突變，千人計(jì)劃中全部測(cè)序樣本中無關(guān)于此SNP的頻率信息，200例正常測(cè)序樣本中無關(guān)于此SNP的頻率信息。 患兒的父親(Ⅰ：1)攜帶c.5134-1G>A雜合突變，而患兒的母親(Ⅰ：2)攜帶c.5324A>C雜合突變(圖1)。

病例2及家庭成員(NSHL-02)：在患兒檢出MYO15A基因第二外顯子c.374delG雜合突變和外顯子56亞區(qū)c.9358C>T雜合突變，千人計(jì)劃中全部測(cè)序樣本中無關(guān)于此SNP的頻率信息，200例正常測(cè)序樣本中無關(guān)于此SNP的頻率信息。 患兒的父親(Ⅰ：1)攜帶c.9358C>T雜合突變，而患兒的母親(Ⅰ：2)攜帶c.374delG雜合突變(圖2)。

2.2MYO15A基因突變預(yù)測(cè) MYO15A基因c.5134-1G>A為剪接突變，該突變位于MYO15A基因編碼的肌球蛋白15的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域，可能導(dǎo)致mRNA的剪接過程發(fā)生異常，Mutation Taster預(yù)測(cè)可能損害編碼蛋白質(zhì)的功能。MYO15A基因c.5324A>C為錯(cuò)義突變，MYO15A基因編碼肌球蛋白15，其1 775位谷氨酸替換成脯氨酸，位于肌球蛋白15的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域，用SIFT和Polyphen軟件對(duì)其蛋白功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果均為有害。MYO15A基因 c.374delG為框移突變，該突變位于肌球蛋白15的N末端結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其編碼的肌球蛋白15序列第125精氨酸突變之后還是變成了精氨酸，使終止密碼子提前到319位，產(chǎn)生截短蛋白或被降解。

圖1 NSHL-01家庭 MYO15A基因新的突變(參考序列NM-016239) 通過病例1父母的血液DNA測(cè)序,驗(yàn)證突變,a:c.5134-1G>A雜合突變,是遺傳其父親的;b:c.5324A>C雜合突變,是遺傳其母親的。

圖2 NSHL-02家庭 MYO15A基因新的突變(參考序列NM-016239) 通過病例2父母的血液DNA測(cè)序,驗(yàn)證突變,a:c.374delG雜合突變,是遺傳其母親的;b:c.9358C>T雜合突變,是遺傳其父親的。

MYO15A基因c.9358C>T，為無義突變，該突變位于肌球蛋白15的第二個(gè)肌球蛋白尾部同源物4(MyTH4)的結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致其編碼的肌球蛋白15序列第3 120位谷氨酰胺變?yōu)榻K止密碼子，該突變可能導(dǎo)致編碼蛋白序列提前終止，產(chǎn)生截短蛋白或提前終止。

2.3胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果 應(yīng)用sanger測(cè)序法分析NSHL-02家庭中胎兒MYO15A基因突變情況，發(fā)現(xiàn)胎兒攜帶c.9358C>T雜合突變，不攜帶c.374delG雜合突變，表型為正常的可能性大。經(jīng)遺傳咨詢后，母親選擇繼續(xù)妊娠，胎兒足月分娩后，采取足跟血進(jìn)行基因診斷，結(jié)果與產(chǎn)前診斷一致，且嬰兒發(fā)育正常，已通過新生兒聽力篩查。

3 討論

MYO15A基因突變是全球?qū)е路蔷C合征型耳聾常染色體隱性遺傳最常見的原因之一[2]。第一次報(bào)道的DFNH3表型聽力損失病例是印度尼西亞一個(gè)偏僻村莊的患者，該村莊有2%的人口有聽力損失[6]；隨后，研究發(fā)現(xiàn)該村莊兩個(gè)沒有血緣關(guān)系的家庭的感音性聽力損失者主要基因突變與肌球蛋白15A(MYO15A)基因有關(guān)[7]。已報(bào)道有192個(gè)MYO15A的隱性突變與聽力損失有關(guān)[8]，本研究中確定的四個(gè)突變是新發(fā)現(xiàn)的，分別是病例1 MYO15A基因的c.5134-1G>A和c.5324A>C以及病例2 MYO15A基因的c.9358C>T和c.9358C>T，國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道。

MYO15A基因是在17p11.2染色體上，橫跨71 kb，由66個(gè)外顯子組成，編碼3 530個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，即肌球蛋白15A。MYO15A基因突變會(huì)引起常染色體非綜合征型感音神經(jīng)性聾，其分子包括三個(gè)進(jìn)化上相對(duì)保守的區(qū)域(頭部、頸部和尾部)；頭部區(qū)域包括N末端結(jié)構(gòu)域和運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域，運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)ATP活性，并且包含ATP和肌動(dòng)蛋白的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；頸部區(qū)域包含鈣調(diào)蛋白輕鏈結(jié)合的IQ基序；尾部區(qū)域包括2個(gè)MyTH4(肌球蛋白尾部同源物4)結(jié)構(gòu)域，2個(gè)FERM結(jié)構(gòu)域，1個(gè)SH3(src同源3)結(jié)構(gòu)域，C末端亞型I和PDZ的結(jié)合基序[7]。MYO15A在內(nèi)耳毛細(xì)胞立體細(xì)胞的分化和伸長(zhǎng)中的作用非常重要，對(duì)于毛細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白組織形成也是必需的[9]。

純合子shaker-2轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)，在小鼠發(fā)育早期，由于該結(jié)構(gòu)域中的終止密碼子的提前出現(xiàn)，從而導(dǎo)致在shaker-2轉(zhuǎn)基因小鼠中MYO15A的缺失，這些小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的耳聾，類似于在人類DFNH3患者中觀察到的耳聾表征[10,11]。本研究中，病例1的MYO15A基因復(fù)合突變(c.5134-1G>A的剪接突變和c.5324A>C錯(cuò)義突變)位于MYO15A的運(yùn)動(dòng)結(jié)構(gòu)域中，該結(jié)構(gòu)域包含ATP和肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，在體外產(chǎn)生移動(dòng)肌動(dòng)蛋白絲的能量；這些突變對(duì)蛋白質(zhì)的功能具有有害影響。

MYO15A基因的第二個(gè)外顯子巨大，目前發(fā)生在第二外顯子上的突變數(shù)也是最多的;但發(fā)生在第二外顯子上的一些突變臨床表現(xiàn)為中度聽力損失[8]；本研究病例2 MYO15A基因復(fù)合突變包括c.374delG的框移突變和c.9358C>T的無義突變，c.374delG的框移突變位于MYO15的N末端結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生截短蛋白；該患兒的言語頻率平均聽閾為55 dB HL。c.9358C>T的無義突變位于第二個(gè)MyTH4結(jié)構(gòu)域；MyTH4結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基非常保守，該結(jié)構(gòu)域的突變對(duì)MYO15A的正常結(jié)構(gòu)和功能有顯著影響，從而引起的DFNH3型聾較為嚴(yán)重[12]。

在常染色體非綜合征型感音神經(jīng)性聾患者家族中，經(jīng)常涉及到GJB2和SLC26A4兩個(gè)基因突變,而且許多研究只集中在這兩個(gè)基因；在漢族人群中也有關(guān)于MYO15A基因突變的報(bào)道，均為應(yīng)用芯片捕獲高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行的檢測(cè)，分別報(bào)道為p.Gly1441Val和p.Arg2923＊等突變[13,14]；而本研究在兩個(gè)NSHL患兒及家庭成員中發(fā)現(xiàn)MYO15A基因4個(gè)新發(fā)現(xiàn)的突變；故在未來的基因序列突變分析中，需要確定MYO15A基因突變的確切突變頻率，在進(jìn)行聽力損失患者的遺傳學(xué)檢測(cè)中應(yīng)密切關(guān)注該基因；同時(shí)攜帶MOY15A基因突變的患兒父母再次懷孕時(shí)，應(yīng)通過抽取絨毛膜細(xì)胞或羊水進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，有助于預(yù)防缺陷兒的出生。