新生兒耳聾防控體系建設的歷程與現(xiàn)狀(Ⅱ)：遺傳性聾的三級預防*

袁濤 曾祥麗

遺傳性聾嚴重影響患兒的言語和認知發(fā)育，甚至嚴重影響患兒的智力發(fā)育， 更會導致人際交往的嚴重障礙， 給家庭和社會帶來沉重負擔。隨著遺傳學的發(fā)展和分子診斷技術的進步，越來越多的耳聾基因被發(fā)現(xiàn)，耳聾基因檢測在遺傳性聾的診斷與預防中發(fā)揮著重要作用；而基于耳聾基因檢測的遺傳性聾的三級預防，可有效地減少遺傳性聾患兒的出生，對已出生的患兒也可早發(fā)現(xiàn)和干預?，F(xiàn)對遺傳性聾三級預防的現(xiàn)狀和進展綜述如下。

1 遺傳性聾概述

先天性聽力障礙是一種常見的感覺缺失，其發(fā)病率為1‰～3‰[1]，其中50%～60%與遺傳因素密切相關[2]。大約70%遺傳性聾是非綜合征性聾(nonsyndromic hearing impairment,NSHI)，僅表現(xiàn)為聽力損失，而無其他臨床癥狀及體征[3]。NSHI具有高度的遺傳異質性，國內外學者對其進行了較深入的研究，不斷地克隆新的耳聾基因和定位新的耳聾基因位點；截至2017年，全世界學者共定位克隆非綜合征型聾基因87個，綜合征型聾基因48個[4]。

針對中國人群的研究顯示，耳聾的分子病因聚焦于幾個重要致聾基因的突變，主要有 GJB2基因 (gap junction protein beta-2 gene, GJB2 gene)、GJB3 基因(gap junction protein beta-3 gene, GJB3 gene)、SLC26A4 基因(SLC26A4 gene 或 PDS gene)、線粒體12S rRNA(mtDNA)[5]。GJB2基因編碼縫隙連接蛋白，參與相鄰細胞間的信息傳導和物質交換，其突變易導致感音神經性聾[6]；GJB3是我國夏家輝院士發(fā)現(xiàn)的首個中國本土耳聾相關基因，也編碼一個縫隙連接蛋白，其突變會導致語后進行性高頻感音神經性聾[7]；SLC26A4基因的突變與大前庭水管綜合征密切相關，導致前庭水管擴大和感音神經性聾[8]；線粒體DNA 12S rRNA基因是一個與氨基糖苷類抗生素致聾相關的基因，其突變會導致藥物性聾[9]。GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體DNA 12S rRNA突變的攜帶率[10，11]分別為3.01%、0.37%、2.02%和0.19%，總體攜帶率約為6%。因此，僅依賴對于聽力障礙人群的篩查和干預尚不足以從根本上阻斷遺傳性聾在整個人群中的傳遞和發(fā)病，如果年輕夫婦在婚檢或生育前進行耳聾基因篩查，可避免雙方均為同一耳聾突變基因攜帶者的夫婦生育聾兒；對新生兒行耳聾基因篩查，明確潛在危險因素，并進行早期干預，可以避免或有效減輕家庭痛苦和負擔。

2 遺傳性聾的三級預防

耳聾基因的分子流行病調查結果顯示，與NSHI相關的基因中，GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA和GJB3基因的突變導致了大部分的遺傳性聾，前三種所占的比例分別為21%[12，13]、14.5%[14，15]、3.8%[16，17]，GJB3基因暫無有效流行病學資料(相關文獻樣本量較小)。因此，對以上四種基因進行篩查可以為我國至少40%的耳聾患者明確分子病因診斷；GJB2與SLC26A4 相關耳聾主要為常染色體隱性遺傳，GJB3相關耳聾為常染色體顯性遺傳或常染色體隱性遺傳，線粒體12S rRNA突變表現(xiàn)為對氨基糖苷類藥物敏感，遵循母系遺傳方式。依據(jù)以上理論，可在臨床中廣泛開展耳聾基因檢測，實現(xiàn)遺傳性聾的三級預防[18]，一級預防主要通過對中國整體人群，尤其是重點懷疑和高危人群，婚育前行耳聾基因普遍性篩查，對男女雙方篩查都未通過者，進行婚育指導，對有高度遺傳風險的夫妻應盡量避免孕育子女；二級預防是產前耳聾基因篩查和產前診斷，以減少耳聾患兒的出生；通過對遺傳性聾家庭的產前診斷，判斷胎兒是否存在致聾基因突變，并告知家庭，便于家庭決定是否繼續(xù)妊娠；三級預防指對耳聾患兒的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早干預，開展新生兒聽力篩查及耳聾基因篩查，以早期了解新生兒的耳聾基因攜帶情況及聽力情況[19]。

2.1婚前或產前耳聾基因篩查 我國現(xiàn)行的婚前或產前耳聾基因篩查主要是運用耳聾基因芯片對夫妻雙方進行檢測，根據(jù)夫妻雙方的檢測結果進行指導[20]。目前，多數(shù)耳聾基因芯片包括4個耳聾易感基因的9個突變位點[7，8]，分別為GJB2的235delC、35delC、176_191del 16、 299_300del AT，GJB3的538C>T， SLC26A4的 IVS 7_2 A>G、 2168 A>G，以及線粒體12S rRNA 的1494C>T、1555A>G等。Kelley等[21]在1998年首次報道GJB2基因的109G>A突變，其突變頻率為0.5%；后續(xù)報道表明，109G>A作為一種致病突變以純合和/或雜合突變的形式存在，同時聽力正常人群中也發(fā)現(xiàn)改突變攜帶者[22]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在東亞人群中，109G>A突變與輕、中度聽力損失相關[23,24]。Mahdieh等[25]對伊朗人耳聾基因突變分析發(fā)現(xiàn)，與耳聾相關的GJB2基因突變有45種，SLC26A4基因有10種?？梢?，基因篩查所針對的9種熱點突變僅能檢出部分致聾突變，即使耳聾基因篩查通過的夫婦也存在攜帶耳聾基因的風險。遺傳性聾可由不同的等位基因突變引起，具有明顯的異質性，因此，耳聾基因篩查位點都是源于對某一地域耳聾人群進行大規(guī)模分子流行病學調查的結果。有學者報道[26]，根據(jù)前期大規(guī)模聾病分子流行病學調查數(shù)據(jù)，設計基因芯片的篩查位點為SLC26A4基因的IVS7-2A>G、2168A>G、1229C>T、1975G>C、1174A>T、1226G>A、2027T>A和IVS15+5G>A及7個其他基因突變位點(GJB2基因的35delG、176del16、235delC、 299delAT，12SrRNA基因的1555G>A、1494C>T，GJB3基因的538C>T)，與傳統(tǒng)的基因芯片比較，該十五項遺傳性聾基因突變微陣列診斷芯片可滿足臨床遺傳性聾基因檢測需求，并進一步提高大前庭水管綜合征(EVAS)患者的陽性檢出率和確診率。表1[27～29]中數(shù)據(jù)來源于華北地區(qū)，可以看出篩查的位點越多，總檢出率越高，與來源于華南地區(qū)數(shù)據(jù)[30]比較，各基因突變檢出率存在差異，檢測的突變種類也不相同?？梢?，各地區(qū)篩查的基因種類及突變位點、檢出率存在差異，表明在基于流行病學調查的基礎上增加基因篩查的位點，有利于提高檢出率，促進遺傳咨詢質量的提高。

國內有研究報道[20]，對3 205例孕婦進行宣教后，3 000例愿意接受耳聾基因篩查，接受率高達93.60%；經篩查共發(fā)現(xiàn) 146例孕婦攜帶耳聾基因突變，其中91例攜帶GJB2突變，49例攜帶SLC26A4突變，6例攜帶線粒體DNA A1555G突變，在140名攜帶GJB2或SLC26A4突變的孕婦中，僅83 例孕婦的配偶接受建議進行了基因篩查，接受率59.29%，明顯低于孕婦接受率；篩查共發(fā)現(xiàn)6 對夫婦同為 GJB2 或 SLC26A4攜帶者，該文獻未分開說明夫婦同為GJB2或SLC26A4攜帶者的例數(shù)，4對夫婦接受建議進行了產前診斷， 接受率66.67%。以上數(shù)據(jù)提示大部分孕婦愿意接受耳聾基因篩查，而孕婦配偶認為夫妻雙方攜帶同一基因突變的幾率低，存在僥幸心理，或擔心自己作為耳聾基因突變攜帶者，會招致家人的誤解與歧視，帶來不必要的麻煩等原因，使得接受率明顯低于孕婦；同時，攜帶同一耳聾基因的夫婦，接受產前診斷，進入下一階段的接受率較低，雖只有6例，樣本量較小，但其中存在的問題不容忽視。Guillemin等[31]強調基因檢測知情的重要性，參與調查的多數(shù)人表示，只有在得到耳聾遺傳咨詢有關信息后才支持基因檢測；Sandor等[32]再次強調保護基因檢測者隱私的重要性，并提出應該制定專門的法律進行保護；而Laskey等[33]發(fā)現(xiàn)，在對耳聾患者進行相關知識的詳細講解后，其對基因檢測的關注度比講解前明顯提高，提示應該做好相關知識的宣傳，注重咨詢者對耳聾基因檢測的知情同意及保護他們的遺傳隱私；現(xiàn)階段，針對孕婦的耳聾基因篩查已經有很好的工作基礎，但后續(xù)的對篩查結果陽性孕婦的配偶基因檢測及同一耳聾基因攜帶者夫婦的產前診斷工作存在嚴重缺失，表現(xiàn)為僅有孕婦的篩查結果，無配偶的結果，攜帶者夫婦無產前診斷結果，缺少完整的基因檢測報告，使得產前指導不能有效的進行，不利于避免生育耳聾患兒的潛在風險。

表1 不同作者報道的華北、華南地區(qū)新生兒耳聾基因篩查突變位點、例數(shù)及檢出率*

注：*數(shù)據(jù)來源于CNKI、PubMed數(shù)據(jù)庫

因線粒體的母系遺傳規(guī)律，基因檢測只做預測，無須產前診斷，若基因篩查提示孕婦為線粒體12S rRNA基因突變攜帶者，只要告知其家庭的母系后代終生絕對禁止使用氨基糖苷類抗生素，就可以在家庭內避免絕大部分藥物性聾的發(fā)生。在該模式下，對聽力正常孕婦進行耳聾基因篩查，再對攜帶者的配偶進行基因芯片檢測，相比孕前或產前要求夫妻雙方同時進行基因芯片檢測的模式，降低了成本，同時也提高了檢測的效率，有利于婚前或產前耳聾基因篩查的普及。

2.2產前診斷 對于有耳聾家族遺傳史和通過耳聾基因檢測已明確遺傳模式的家庭，借助產前診斷技術可有效避免遺傳性聾患兒的出生。針對耳聾的產前診斷是指在確定為常染色體隱性遺傳性聾的基礎上，在母親妊娠期的一定階段，胎兒出生之前行耳聾基因檢測，確定胎兒的耳聾基因型，從而做出胎兒是否可能為遺傳性聾的診斷。產前診斷耳聾的傳統(tǒng)方法主要采取微創(chuàng)法，根據(jù)妊娠期不同階段采取相應的組織，如：妊娠早期(約9～12周)羊水絨毛膜取樣，妊娠中期(約16～20周)羊水取樣，妊娠晚期(約22～37周)臍帶血取樣；以上操作均有出現(xiàn)微小比例并發(fā)癥的可能，如：出血、宮腔感染、流產等，因此，無創(chuàng)性產前診斷技術的改進日益受到重視。目前研究主要集中于孕婦外周血中胎兒游離DNA(cell free fetal DNA, cffDNA)的分析，Lun等[34]發(fā)現(xiàn)cffDNA的濃度可以達到母血中總DNA的10%；研究表明在妊娠 7 周就可以在孕母外周血中檢測到cffDNA，其濃度隨孕齡增加而升高[35]， 并且在分娩后迅速從母血循環(huán)中清除，平均半衰期為16 min，且本次妊娠所進行的各項產前檢測不會受到上次妊娠的影響[36]；因此，可利用母體外周血中的cffDNA檢測胎兒染色體疾病和基因突變疾病。雖然，當前cffDNA主要用于檢測染色體非整倍體異常疾病，如：21三體綜合征[37]，但是對單基因病的產前診斷也越來越受到重視。由于cffDNA處于強大的孕母 DNA 背景中，目前主要用于檢測非母系遺傳的等位基因，例如：Y染色體序列、RhD血型陽性胎兒檢出、父系遺傳的基因等[38]；而Lun等[39]設計數(shù)字 PCR 法檢測孕母血漿中突變體和正常等位基因的數(shù)量，比較它們之間的相對量，這種方法被稱為相對突變劑量(RMD)，該方法解決了在孕母DNA背景中檢測胎兒從母親遺傳來的等位基因，被證明是適用于β-地中海貧血、鐮狀細胞性貧血和血友病的非創(chuàng)傷性檢測。2008年，Chiu等[40]首次應用大規(guī)模平行基因組測序技術(massively parallel genomic sequencing， MPGS) 檢測 cffDNA；Lo等[41]在孕 12 周采集夫婦均是 β-地中海貧血基因突變攜帶者的母親外周血，用MPGS方法對孕母血漿 DNA 進行全基因組測序，獲得了完整的胎兒及孕婦的基因組序列，構建了全基因組遺傳圖譜，為直接利用 cffDNA開展無創(chuàng)性產前基因診斷開辟了新途徑；大量的研究報道表明cffDNA用于無創(chuàng)性耳聾基因產前診斷有廣泛的應用前景。

目前，產前診斷方法主要是通過超聲引導下在胎盤上抽取絨毛組織、羊膜腔穿刺抽取羊水、臍帶穿刺抽取臍血等微創(chuàng)性取樣法，提取胎兒DNA進行耳聾基因測序，獲取胎兒耳聾基因的遺傳信息，再結合運用短串重復序列連鎖分析(STR，既特異性分析人類基因組DNA中廣泛存在的一類具有高度多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性的遺傳標記，以鑒別母體和胎兒的染色體)排除母血污染，以保證檢測的準確性。因此，通過胎兒的遺傳信息來預測新生兒耳聾風險，是產前診斷的關鍵。目前，產前診斷主要針對GJB2和SLC26A4基因，但大量的研究表明，不同的兩個致病突變形成復合雜合突變時也可致聾，在GJB2基因突變中，Wilcox等[42]研究發(fā)現(xiàn)109G>A 純合和復合雜合突變與耳聾有關；Campbell等[43]在一位葡萄牙女性耳聾患者的家系研究發(fā)現(xiàn)，-3438C>T和250G>A突變?yōu)閺秃想s合子后會導致耳聾；有研究[44, 45]報道，SCL26A4基因1229C>T、754T>C 的復合雜合突變會致聾。胡鵬等[46]在一項研究中發(fā)現(xiàn)1例2086C>T和IVS7-2A>G復合雜合突變的患者表現(xiàn)為前庭水管擴大伴極重度聾，后續(xù)調查表明c.2086C>T為新的致聾突變；因此，在產前診斷中發(fā)現(xiàn)純合突變和已明確致聾的雜合突變，可以預測胎兒有出現(xiàn)耳聾的風險；但當發(fā)現(xiàn)未明確致聾性的雜合突變時，就很難預測胎兒是否會出現(xiàn)耳聾。上述研究報道中提示，有大量的耳聾基因還未被發(fā)現(xiàn)，當在產前篩查中發(fā)現(xiàn)新型的基因突變時，尚無相關證據(jù)判斷新突變是否會致聾，應進一步隨訪觀察。

產前診斷可為有遺傳性聾家族史的家庭生育前及已生育耳聾患兒的家庭再生育前預測生出耳聾患兒的風險，對這些家庭進行產前指導和干預；同時，隨著遺傳學和無創(chuàng)性產前診斷技術的完善，相信遺傳性聾的產前診斷將在降低我國耳聾患兒出生率的工作中發(fā)揮重要作用。

2.3新生兒耳聾基因篩查 我國對新生兒已實行普遍聽力篩查，然而隨著新生兒聽力篩查工作的廣泛開展和臨床經驗的積累，逐漸發(fā)現(xiàn)在新生兒聽力篩查中存在一個重大的局限，即并不是所有的聽力損失均會在出生后立即表現(xiàn)出來。2006 年，Norris等[47]報道了9例表現(xiàn)為遲發(fā)性聽力損失的兒童，其中4例最初采用OAE聽力篩查，3例采用ABR聽力篩查，另外2 例無法確認其所用的聽力篩查方法，但均為聽力篩查通過。然而在12～60個月齡分別被確診為耳聾；9例中3例為GJB2 基因的復合雜合突變，6例為35delG純合突變，所鑒定出的3 種非35delG 的突變分別為 312de l14、delE120及V37I。這9個病例說明現(xiàn)行的聽力篩查不能全部篩查出GJB2突變的新生兒，提示存在聽力損失遲發(fā)而被單純聽力篩查漏檢的情況。為了彌補新生兒普遍聽力篩查的不足和局限，Morton[48]、王秋菊等[49]分別在2006年、2007年提出了新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查的理念，至今，聯(lián)合篩查已在中國大陸和臺灣地區(qū)廣泛展開。

目前，新生兒耳聾基因篩查通過收集新生兒的臍帶血或足跟血，運用基因檢測技術，對常見耳聾基因GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12S rRNA的9個突變位點進行篩查。當新生兒為12S rRNA基因突變攜帶者時，提示該新生兒的所有母系成員都有可能是突變攜帶者，需篩查該基因位點，攜帶該基因突變者必須被告之終生避免使用氨基糖苷類抗生素。GJB3基因突變既可以常染色體顯性遺傳模式遺傳，也可以常染色體隱性遺傳模式遺傳，該基因攜帶者可能為遲發(fā)性聾患者，當新生兒攜帶該基因且聽力測試正常時應密切隨訪監(jiān)測聽力；若家族內有該基因突變的先證者，可根據(jù)基因型，預測攜帶者是否可能存在遲發(fā)性聾。對于GJB2基因及SLC26A4基因的篩查，若基因篩查結果為純合突變或復合雜合突變，且確診新生兒聽力障礙，則可以診斷該新生兒為基因突變導致的耳聾，需立即采取醫(yī)學干預；若基因篩查為純合突變或復合雜合突變，而聽力篩查通過，則可能為基因突變導致的遲發(fā)型聾，必須進行嚴密的隨訪，定期檢測聽力；若基因篩查為攜帶者，且聽力篩查通過，提示該新生兒成年后與具有相同基因型的攜帶者婚配時則其后代發(fā)病率為25%。

對于新生兒聽力與耳聾基因聯(lián)合篩查的結果均無異常者，則轉入隨訪程序；聽力篩查不通過并且耳聾基因篩查發(fā)現(xiàn)純合突變或復合雜合突變者，應確認耳聾分子病因，則進行相應干預；聽力篩查通過而只發(fā)現(xiàn)單等位基因的突變者，歸類為雜合突變攜帶者則進行密切觀察隨訪；聽力篩查不通過并且只發(fā)現(xiàn)單等位基因的突變，則需要進一步的分子診斷。有研究報道，攜帶SLC26A4單等位基因突變的耳聾患者中有一定比例表現(xiàn)為不同程度聽力障礙[50]，分析其另外的突變可能位于非外顯子區(qū)域，通過現(xiàn)有方法尚不能檢測出來；對于此類篩查結果，可認為該突變引起耳聾。高儒真等[51]報道，耳聾基因篩查發(fā)現(xiàn)622例新生兒GJB2基因突變，其中攜帶至少1個c.235delC、c.176_191del16、c.299_300delAT或c.35delG突變的例數(shù)分別為467、26、12和3例；其中純合突變5例，復合雜合突變1例；同期聽力篩查顯示90.8%通過篩查，但該報道沒有后續(xù)的研究；現(xiàn)階段對此類新生兒多進行隨訪，定期監(jiān)測小兒的聽力，一旦發(fā)現(xiàn)其聽力下降應及時進行干預；因此，加強對此類新生兒聽力與基因型關系的深入研究，有利于促進新生兒耳聾基因篩查與遺傳咨詢的開展與完善。

3 前景及展望

近年來，隨著耳聾基因研究的深入和高通量測序技術的發(fā)展，使得耳聾基因篩查在耳聾防控體系中發(fā)揮了越來越重要的作用。耳聾基因的婚前或產前篩查將遺傳性聾預防提前至生育前，從根本上阻斷遺傳性聾的傳遞和發(fā)病， 實現(xiàn)耳聾一級預防；產前診斷對未出生的胎兒行耳聾基因檢測，在出生前預測胎兒出現(xiàn)耳聾的風險，對高風險的家庭提供生育指導，減少聾兒的產生，實現(xiàn)耳聾的二級預防；新生兒耳聾基因篩查結合聽力篩查，發(fā)現(xiàn)新生兒是否攜帶耳聾基因，是否存在聽力障礙，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預，實現(xiàn)耳聾的三級預防。但目前我國主要實施新生兒耳聾基因篩查結合聽力篩查模式，產前篩查及產前診斷的覆蓋率低，僅在經濟發(fā)達的部分城市實行。

隨著精準醫(yī)療計劃的提出，可以預見大規(guī)模的耳聾出生缺陷預防勢在必行。為適應規(guī)?；亩@防控，建議對某一地域行大規(guī)模聾病分子流行病學調查，設計符合該地域情況的基因芯片，以保證盡可能的篩查出耳聾基因突變者；建立和完善耳聾基因會診、轉診的網(wǎng)絡平臺，對于沒有條件進行基因診斷和遺傳咨詢的醫(yī)院確?？梢赞D診到上級醫(yī)院；對已檢測到致聾基因的新生兒應進行密切的隨訪，以保證新生兒耳聾基因篩查實施的質量。因此，建議廣東省可先在經濟及醫(yī)療技術發(fā)達的廣州市實行遺傳性聾的三級預防，逐步推進以廣州市為中心并擴展至整個廣東省的耳聾三級防控網(wǎng)絡；同時，建立完善的遺傳性聾的三級預防體系還需不斷的探索研究。