實(shí)驗(yàn)室克侖特羅殘留檢測(cè)方法比對(duì)

（北京市朝陽(yáng)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

2006年9月17日，上海連續(xù)發(fā)生“瘦肉精”食物中毒事故，波及全市9個(gè)區(qū)、300多人。

2011年3月15日“雙匯瘦肉精”事件曝光至23日18時(shí)，查獲含“瘦肉精”飼料若干批次。

“瘦肉精”是一類動(dòng)物用藥，而不是一種特定的物質(zhì)，是指能夠促進(jìn)瘦肉生長(zhǎng)的飼料添加劑，有數(shù)種藥物被稱為瘦肉精，例如鹽酸克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等能夠?qū)崿F(xiàn)這種功能的物質(zhì)，又叫作β-興奮劑的藥物，將瘦肉精添加于飼料中，可以增加動(dòng)物的瘦肉量、抑制肥肉生長(zhǎng)、減少飼料使用、使肉品提早上市、降低成本，但在組織和內(nèi)臟中殘留量很大。

我中心實(shí)驗(yàn)室肩負(fù)著讓全區(qū)老百姓吃上“放心肉”的重要責(zé)任，作為“菜籃子工程”的第一道安全防線，我們有必要努力追求工作的質(zhì)量與效率，自從2009年開(kāi)展了克侖特羅的實(shí)驗(yàn)室初篩檢測(cè)，經(jīng)過(guò)比對(duì)與篩選，2012年復(fù)認(rèn)證時(shí)最終選定了北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的克侖特羅快速檢測(cè)卡（Ⅱ型）和萊克多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒（三合一）。并于2013年底購(gòu)置一臺(tái)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（島津20A+AB的API5000），積極學(xué)習(xí)與開(kāi)展，在2015年6月通過(guò)實(shí)驗(yàn)室計(jì)量認(rèn)證成功擴(kuò)項(xiàng)，使我實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)了克侖特羅藥物殘留檢測(cè)從初篩到定性確證的整套流程。日常監(jiān)測(cè)中時(shí)有出現(xiàn)的陽(yáng)性樣品，使我統(tǒng)計(jì)了檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，并自己設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，對(duì)目前可以開(kāi)展的三項(xiàng)不同的檢測(cè)手段進(jìn)行準(zhǔn)確性和可信度比較，從我實(shí)驗(yàn)室角度分析了幾種檢測(cè)手段臨床使用的可行性和適用性，以及給出的檢測(cè)結(jié)果的臨床參考意義。

1 檢測(cè)方法詳解

1.1 膠體金免疫層析法

1.1.1 原理

利用競(jìng)爭(zhēng)法膠體金免疫層析技術(shù)，檢測(cè)卡含有被事先固定于硝酸纖維素膜測(cè)試區(qū)（T）的抗原和控制區(qū)（C）的Ⅱ抗，以及固定于結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體。檢測(cè)液中的Clen與金標(biāo)墊上的金標(biāo)抗體結(jié)合形成復(fù)合物，若Clen在檢測(cè)液中濃度低于靈敏度值，未結(jié)合的金標(biāo)抗體流到T區(qū)時(shí)，被固定在膜上的Clen-BSA偶聯(lián)物結(jié)合，逐漸凝集成一條可見(jiàn)的T線；若Clen濃度高于靈敏度值，金標(biāo)抗體全部形成復(fù)合物，不會(huì)再與T線處Clen-BSA偶聯(lián)物結(jié)合形成可見(jiàn)T線。未固定的復(fù)合物流過(guò)T區(qū)被C區(qū)的二抗捕獲并形成可見(jiàn)的C線。C線出現(xiàn)則表明免疫層析發(fā)生，即試紙有效。

以我實(shí)驗(yàn)室使用的北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的克侖特羅快速檢測(cè)卡（Ⅱ型）為例。

1.1.2 檢測(cè)步驟

（1）使用前將試劑板和待檢樣本溶液恢復(fù)至室溫。

（2）取5g勻漿去脂肉樣于50mL離心管中，放入沸水中加熱10min，用微量移液器或滴管取出管中液體移至干凈離心管中，冷卻至室溫（注意：樣品溫度應(yīng)控制在20±5℃！）。

（3）取出檢測(cè)卡，平放于桌面，使用本產(chǎn)品自帶的滴管，吸取離心管中的上清液加3～4滴于樣品孔中。

（4）加樣后3～5min，觀察顯色區(qū)，判斷結(jié)果，其他時(shí)間判斷無(wú)效。

結(jié)果判讀：陽(yáng)性（+）：僅質(zhì)控區(qū)（C）出現(xiàn)一條紫紅色條帶。在測(cè)試區(qū)（T）內(nèi)無(wú)紫紅色條帶出現(xiàn)。

陰性（-）：兩條紫紅色條帶出現(xiàn)。一條位于測(cè)試區(qū)（T）內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)（C）內(nèi)。

無(wú)效：質(zhì)控區(qū)（C）未出現(xiàn)紫紅色條帶，無(wú)論測(cè)試區(qū)（T）內(nèi)有無(wú)紫紅色條帶出現(xiàn)，都提示測(cè)試失敗或試紙已失效。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

1.2.1 原理

利用免疫學(xué)抗原抗體特異性結(jié)合和酶的高效催化作用，通過(guò)化學(xué)方法將植物辣根過(guò)氧化物酶（HRP）與克侖特羅（CL）結(jié)合，形成酶偶聯(lián)克侖特羅。將固相載體上已包被的抗體與特異性的抗克侖特羅抗體結(jié)合，然后加入待測(cè)克侖特羅和酶偶聯(lián)克侖特羅，它們競(jìng)爭(zhēng)性與克侖特羅抗體結(jié)合，洗滌后加底物，根據(jù)有色物的變化計(jì)量待測(cè)克侖特羅量。若待測(cè)克侖特羅多，則被結(jié)合的酶偶聯(lián)克侖特羅少，有色物量就少。用目測(cè)法或比色法測(cè)定樣品中的克侖特羅含量，比色的最佳波長(zhǎng)為450 nm，參比波長(zhǎng)應(yīng)大于600 nm。

以我實(shí)驗(yàn)室使用的北京維德維康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的萊克多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒（三合一）為例。

1.2.2 檢測(cè)步驟

（1）試劑

①組織稀釋液：稱取1g三氯乙酸，加入100ml去離子水充分溶解。

②1M氫氧化鈉溶液：稱取4g氫氧化鈉加入去離子水溶解并定容至100ml。

③0.5M氫氧化鈉溶液：稱取2g氫氧化鈉加入去離子水溶解并定容至100ml。

④0.1M鹽酸溶液：量取0.86ml濃鹽酸并用去離子水定容至100ml。

⑤洗滌工作液：用去離子水按1份濃縮洗滌液+19份去離子水稀釋。

（2）樣品前處理

①準(zhǔn)確稱取2±0.01g勻質(zhì)后的樣品于50ml離心管中；

②加入3mL洗滌工作液，再加3ml組織稀釋液，高速渦旋1min；

③離心機(jī)4000g以上離心5min；

④取1ml中間層清液于新的離心管中（注意：避免取到上、下層固體，否則影響檢測(cè)結(jié)果?。?；

⑤加入40μl0.5M氫氧化鈉溶液，渦旋10s混勻；

⑥離心機(jī)4000g以上離心5min；

⑦取20μl樣液進(jìn)行檢測(cè)。

（3）檢測(cè)

將所需的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄下各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置；

將40μl各標(biāo)準(zhǔn)品工作液分別加入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品孔中；

先將20μl樣品稀釋液加入樣品孔中，再加入20μl待測(cè)樣品液；

配制酶標(biāo)記物工作液：按1份酶標(biāo)記物濃縮液+10份酶標(biāo)記物稀釋液的體積比混合，輕柔混勻。室溫（25±2℃）平衡20～30min（注意：操作中應(yīng)嚴(yán)格控制該步驟時(shí)間，即工作液平衡20～30min后立即使用?。。?；

在每孔中加入60μl酶標(biāo)記物工作液；

蓋好蓋板膜，輕輕振蕩10s，充分混勻，室溫（25±2℃）避光反應(yīng)30min；

揭開(kāi)蓋板膜，倒掉板孔中液體，每孔加入260μl洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15～30s；

倒掉板孔中液體，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，拍干；

立即在每孔中加入100μl底物A、B混合液（注意：底物A液、底物B液按體積1：1混合，混合液在5min內(nèi)使用，避免使用金屬盛裝、攪拌試劑?。?；

蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫（25±2℃）避光反應(yīng)15～20min；

揭開(kāi)蓋板膜，板孔中加入50μL終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻；

用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630nm下檢測(cè)吸光度，在5min內(nèi)讀取檢測(cè)數(shù)據(jù)。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）

1.3.1 外標(biāo)法

原理：

試樣中的殘留藥物經(jīng)酶解，用高氯酸調(diào)pH值后高速離心沉淀蛋白，上清液調(diào)pH值后分別用乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取，再用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。

以我實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證的《農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》為例。該檢測(cè)方法為外標(biāo)法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬肝、豬肉、牛奶和雞蛋中克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等9種β-受體激動(dòng)劑單個(gè)或混合物殘留量的檢測(cè)。

1.3.2 檢測(cè)步驟

（1）樣品的制備：

取適量新鮮或冷凍的豬肉，絞碎并勻質(zhì)，儲(chǔ)存于-20℃以下備用。

（2）制備試料：

取勻質(zhì)的供試料品作為供試試料；

取勻質(zhì)的空白樣品作為空白試料；

取勻質(zhì)的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液作為空白添加試料。

（3）酶解：

準(zhǔn)確稱取勻漿樣品2.00g于50mL離心管內(nèi)，加入0.2mol/L乙酸銨溶液（pH=5.2）8.0ml，再加入β-鹽酸葡萄糖醛苷酶40μl，渦旋混勻，于37℃避光恒溫振蕩16h。

（4）提?。?/p>

酶解后放置至室溫，渦旋混勻，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50ml離心管中，加入高氯酸溶液5mL，渦旋混勻，用高氯酸調(diào)pH至1.0±0.2，10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50ml離心管中。用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.5±0.2，加入乙酸乙酯15ml，渦旋混勻，振蕩10min，5000r/min離心5min，取上層有機(jī)相至另一離心管中，再在下層水相中加入叔丁基甲醚10mL，渦旋混勻振蕩10min，5000r/min離心5min，合并有機(jī)相，50℃平行蒸發(fā)至干，用甲酸水溶液5mL溶解，備用。

（5）凈化：

MCX固相萃取柱依次用甲醇、2%甲酸水各3mL活化，取備用液全部過(guò)柱，再依次用2%甲酸水、甲醇各3mL淋洗，抽干，用3%氨水甲醇2.5ml洗脫，在50℃下氮?dú)獯蹈?，殘留物用甲?0.1%甲酸溶液（10+90，V/V）0.2ml溶解，渦旋混勻，樣液經(jīng)0.2μm針孔過(guò)濾器過(guò)濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

（6）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件：

色譜柱：BEH C18柱，50 mm×2.1mm（i.d.），粒度1.7μm。

流動(dòng)相：A相：0.1%甲酸乙腈溶液；B相：0.1%甲酸水溶液。

梯度洗脫：0～2min，維持4%A；2-12min，4%A線性變化至60%A；12～12.1min，60%A線性變化至4%A；12.1～16min，維持4%A。

流速：0.3ml/min。

進(jìn)樣量：10μl。

柱溫：30℃。

離子源：電噴霧ESI正離子。

掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM。然后以30℃/min升至260℃，保持1min，再以20℃/min升至280℃，保持2min，直至樣品的組分全部流出。

監(jiān)測(cè)離子對(duì)：克侖特羅m/z 277.1-202.8（定量離子）、277.1-258.9（定性離子）；

（7）質(zhì)譜分析：在上述工作條件下，通過(guò)儀器工作軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以色譜峰面積定量。

（8）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證：

取試料溶液和空白添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，做單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，外標(biāo)法計(jì)算，即得。試料溶液及空白添加標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物的峰面積均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。試料溶液中的離子相對(duì)豐度與空白添加標(biāo)準(zhǔn)溶液中的離子相對(duì)豐度相比，符合允許偏差范圍，方可確定為同一物質(zhì)。

相對(duì)離子豐度 ＞50% ＞20-50% ＞10-20% ≤10%允許的相對(duì)誤差 ±20% ±25% ±30% ±50%

（9）準(zhǔn)確度：本方法在0.25μg/kg～2μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，用空白添加校準(zhǔn)校正，其回收率范圍為70%～120%。

（10）結(jié)果判定：

β-受體激動(dòng)劑液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法的方法檢出限為0.25μg/kg，定量限為0.5μg/kg，判定檢測(cè)結(jié)果大于0.5μg/kg時(shí)為陽(yáng)性。

1.4 內(nèi)標(biāo)法

1.4.1 原理

試樣中的殘留藥物經(jīng)酶解，用高氯酸調(diào)節(jié)pH值，沉淀蛋白后高速離心，上清液用異丙醇-乙酸乙酯提取，再用陽(yáng)離子交換柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。

以我實(shí)驗(yàn)室使用的《GB/T 22286-2008動(dòng)物源性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法》為例。該檢測(cè)方法為內(nèi)標(biāo)法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬肝和豬肉中克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等11種β-受體激動(dòng)劑殘留量的檢測(cè)。

1.4.2 檢測(cè)步驟

參照外標(biāo)法檢測(cè)步驟，僅區(qū)別于外標(biāo)法檢測(cè)步驟2.4提取之前添加100μl的10ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作液于待測(cè)樣品中。

2 檢測(cè)結(jié)果比對(duì)

2.1 日常監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)比對(duì)

從2015年8月至2017年3月，快速檢測(cè)卡初篩檢測(cè)2260份畜禽組織樣品，陽(yáng)性檢出52份；ELISA試劑盒檢測(cè)1080份重合畜禽組織樣品（包含初篩52份可疑樣品），陽(yáng)性檢出32份；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)185份重合畜禽組織樣品（包含初篩52份可疑樣品），陽(yáng)性檢出31份。

與確證結(jié)果不符快速檢測(cè)卡 160 9 16 6 ELISA試劑盒 80 3 22 0液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 22 3 —— ——2015年 樣品數(shù)量 陽(yáng)性樣品 與確證結(jié)果相符與確證結(jié)果不符快速檢測(cè)卡 1500 39 119 12 ELISA試劑盒 800 28 130 1液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 131 27 —— ——2016年 樣品數(shù)量 陽(yáng)性樣品 與確證結(jié)果相符

2017年 樣品數(shù)量 陽(yáng)性樣品 與確證結(jié)果相符與確證結(jié)果不符快速檢測(cè)卡 600 4 29 3 ELISA試劑盒 200 1 32 0液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 32 1 —— ——

2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)比對(duì)

運(yùn)用三種檢測(cè)手段，對(duì)1倍檢出限添加，2倍檢出限添加，5倍檢出限添加，10倍最高檢出限添加結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

2.3 優(yōu)化確證方法數(shù)據(jù)比對(duì)

3 數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)論

3.1 日常監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)論

經(jīng)過(guò)三年對(duì)日常監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，快速檢測(cè)卡初篩檢測(cè)陽(yáng)性檢出率為2.3%，與定量確證結(jié)果符合率為59.6%；ELISA試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性檢出率為2.9%，與定量確證結(jié)果符合率為99.5%；快速檢測(cè)卡初篩與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果符合率為61.5%。據(jù)此可以看出，快速檢測(cè)卡的假陽(yáng)性率比較高，基本不會(huì)疏漏陽(yáng)性樣品，但操作簡(jiǎn)單，日常監(jiān)測(cè)中可以作為有效的初篩手段；ELISA試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確率較高，經(jīng)過(guò)方法認(rèn)證后可以作為日常監(jiān)測(cè)的主要檢測(cè)手段；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法是目前我實(shí)驗(yàn)室具有的最終確證手段，可以達(dá)到準(zhǔn)確定量的目的，但檢測(cè)過(guò)程比較煩瑣，日常進(jìn)行合理的質(zhì)量控制，對(duì)可疑樣品進(jìn)行確證即可。

添加量（μg/kg） 0.03 0.1 0.25 0.5 1.25 2.5 3 5 10快速檢測(cè)卡（3μg/kg） —— —— —— —— —— 18/20 19/20 20/20 20/20 ELISA試劑盒（0.03μg/kg） 2/20 5/20 6/20 12/20 20/20 20/20 20/20 19/20 20/20液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜外標(biāo)法（0.25μg/kg） —— —— —— 19/20 18/20 20/20 20/20 20/20 16/20液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法（0.5μg/kg） —— —— 15/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20 20/20外標(biāo)法實(shí)驗(yàn)次目?jī)?nèi)標(biāo)法準(zhǔn)確度（添加回收率%）（RSD%）曲線相關(guān)系數(shù)準(zhǔn)確度（添加回收率%）精密度精密度（RSD%） 曲線相關(guān)系數(shù)20160128 115～120 28.90～31.33 0.9944～0.9962 105～108.5 0～2.66 0.9995～0.9998 20160212 125～160 8.58～12.40 0.9082～0.9243 100～110 4.76～8.25 0.9988～0.9998 20160417 50～70 21.42～56.78 0.9524～0.9780 80～93.3 4.22～4.68 0.9976～0.9989 20160418 90～160 9.12～14.32 0.9748～0.9997 80～110 5.59～7.53 0.9891～0.9990

3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)論

經(jīng)過(guò)對(duì)520份添加樣品進(jìn)行4種不同方法，不同添加濃度區(qū)間進(jìn)行比對(duì)?？焖贆z測(cè)卡初篩檢測(cè)符合率為98.3%，ELISA試劑盒檢測(cè)符合率為68.9%，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜外標(biāo)法檢測(cè)符合率為94.2%，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)符合率為100%。據(jù)此可以看出，可能由于技術(shù)手段的原因，ELISA試劑盒檢測(cè)無(wú)法達(dá)到說(shuō)明書(shū)推薦的檢出限，其余各種檢測(cè)方法在推薦檢測(cè)區(qū)間的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率非常高，臨床實(shí)踐運(yùn)用中毋庸置疑。

3.3 優(yōu)化確證方法數(shù)據(jù)比對(duì)結(jié)論

通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度的比對(duì)，可以清楚地判斷β-受體激動(dòng)劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)法優(yōu)于外標(biāo)法。內(nèi)標(biāo)法靈敏度高，定性準(zhǔn)確，可以更有效地保證準(zhǔn)確性的穩(wěn)定性，精密度的一致性，同時(shí)保證校正曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求，在一定程度上保證實(shí)驗(yàn)有效，出具結(jié)果準(zhǔn)確，因此，我們?cè)谂R床實(shí)驗(yàn)中推薦將β-受體激動(dòng)劑的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)外標(biāo)法改進(jìn)為內(nèi)標(biāo)法。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)和日常監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)綜合比對(duì)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，ELISA試劑盒檢測(cè)我中心實(shí)驗(yàn)室可操作檢出限需要提高到0.5μg/kg，說(shuō)明日常監(jiān)測(cè)出的可疑陽(yáng)性樣品中克侖特羅殘留量一般高于該數(shù)值。而想真正達(dá)到較低的檢出限水平，目前我實(shí)驗(yàn)室可操作的最好方法就是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)內(nèi)標(biāo)法。

目前，HPLC，GC/MS，CE方法對(duì)β-興奮劑的檢出限均在0.5μg/kg左右，并且檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，必須由專業(yè)人員操作，所用儀器價(jià)格昂貴，不能進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。而ELISA法檢出限可在0.03μg/kg，但也存在假陽(yáng)性的問(wèn)題，也不能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。如果能找到一種檢測(cè)耗時(shí)短、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、自動(dòng)化水平高，無(wú)須專業(yè)人員操作的檢測(cè)方法將具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。