香椿種子無菌苗再生體系的建立

楊超臣，張 婷，朱天然，曹麗仙，李建安

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004）

香椿Toona sinensis楝科Meliaceae香椿屬Toona(Endl.)Roem，是我國珍貴的速生用材樹種，素有“中國桃花心木”之美譽(yù)，也是園林綠化的優(yōu)良樹種，同時(shí)也是兼具營養(yǎng)價(jià)值、食用價(jià)值、藥用價(jià)值的木本蔬菜，主要采食其嫩葉和芽[1]。香椿作為木本蔬菜的栽培方式主要是設(shè)施栽培和矮化密植栽培[2]，其常規(guī)育種方法是根蘗繁殖和種子繁殖。由于香椿根系深，根量少，根蘗繁殖率低，且香椿種子自然條件下萌發(fā)率低。組織培養(yǎng)作為一種高效的無性繁殖技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)種質(zhì)資源創(chuàng)新和良種工廠化培育，現(xiàn)常與其他育種技術(shù)相結(jié)合，如：基因工程、原生質(zhì)融合和花藥培養(yǎng)等，是品種選育和種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要技術(shù)手段[3]。近年來，較多學(xué)者對香椿組培進(jìn)行大量研究，但主要以帶芽莖段[4]、葉片[5]作為初代培養(yǎng)材料，以香椿種子為初始培養(yǎng)材料的研究報(bào)道較少。本研究以成熟香椿種子在無菌條件下萌發(fā)的幼苗為外植體，研究不同基本培養(yǎng)基和不同植物生長調(diào)節(jié)劑對叢芽誘導(dǎo)、增殖、壯苗及生根的影響，建立了完整的組培快繁體系，為香椿的工廠化育苗提供理論基礎(chǔ)，以期為遺傳轉(zhuǎn)化提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

香椿Toona sinensis成熟種子來自河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，常溫避光下保存，試驗(yàn)在中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無菌苗的獲得

試驗(yàn)材料預(yù)處理：挑選大小均勻一致、籽粒飽滿的成熟香椿種子，然后用洗衣粉浸泡10 min，在流水下沖洗2 h，再用40 ℃溫水浸泡催芽，浸種12 h后暗培養(yǎng)24 h。然后經(jīng)75%無水乙醇表面滅菌1 min后用無菌水沖洗4～5次。用以下3種材料滅菌處理：1%NaClO（有效成分）、0.1%HgCl2、10%H2O2，無菌水沖洗4～5次，充分去掉殘余的消毒液，然后將滅菌好的種子放在無菌濾紙上吸干水分，轉(zhuǎn)接至WPM培養(yǎng)基上。每個(gè)處理接種20瓶，每瓶1粒種子，重復(fù)3次，培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)污染率、萌發(fā)率。

1.2.2 培養(yǎng)基的篩選

把預(yù)處理的種子用1% NaClO滅菌處理20 min。分別接種在WPM、MS、1/2MS培養(yǎng)基上，并添加不同濃度GA3（0、3、5 mg·L-1）。每個(gè)處理接種15瓶，每瓶2粒種子，重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)萌發(fā)所用時(shí)間、成苗率，以胚根露出超過種子長度為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，觀察培養(yǎng)40 d后的幼苗生長情況。

1.2.3 叢生芽的誘導(dǎo)

選取培養(yǎng)45 d后長勢一致的香椿無菌苗為材料，切成長度為2.0 cm帶芽莖段，接入含有6-BA（0.5、1.0、2.0 mg·L-1）、NAA（0.05、0.1、0.5 mg·L-1）、GA3（1.0 mg·L-1）的培養(yǎng)基中進(jìn)行叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，45 d后統(tǒng)計(jì)叢芽誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)。每處理接種20個(gè)帶芽莖段，重復(fù)3次。

1.2.4 無菌苗壯苗培養(yǎng)

以培養(yǎng)45 d的香椿叢芽為材料，培養(yǎng)基中添加6-BA（0.5、1.0 mg·L-1）、IAA（0.05、0.1、0.5 mg·L-1）、GA3（2.0 mg·L-1），優(yōu)化出壯苗培養(yǎng)基，45 d后統(tǒng)計(jì)苗高及生長情況。每處理接種20瓶，每瓶1～2個(gè)單芽，重復(fù)3次。

1.2.5 生根培養(yǎng)

以壯苗后的單個(gè)芽苗為材料，切取生長健壯（高度4 cm左右）的單個(gè)芽苗接種在含有IBA（0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1）、NAA（0、0.1、0.5 mg·L-1）的生根培養(yǎng)基上，45 d后統(tǒng)計(jì)生根率、生根條數(shù)及根系生長情況。每處理15瓶，每瓶1～2個(gè)芽苗，重復(fù)3次。

1.2.6 煉苗移栽

將生根45 d的試管苗打開瓶蓋在人工氣候室中煉苗2 d，保持其濕度為65%左右。去掉根部的培養(yǎng)基，然后移栽到園土∶草炭土∶珍珠巖體積比為2∶2∶1的混合基質(zhì)中，移栽初期保持盆內(nèi)微環(huán)境相對濕度為75%～85%。30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率[6]。

1.2.7 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中均添加30 g·L-1蔗糖和7 g·L-1瓊脂，添加植物生長調(diào)節(jié)劑后調(diào)pH值為5.8。121 ℃高溫滅菌20 min。培養(yǎng)條件為：溫度25±2 ℃、光照周期12 h/d、光照強(qiáng)度為30 μmol·m-2s-1、相對濕度為60% ～70%。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2016、SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”格式，采用Duncan’s新復(fù)極差測驗(yàn)法（P＜0.05）進(jìn)行顯著性分析。在結(jié)果統(tǒng)計(jì)中所涉及的測定項(xiàng)目計(jì)算公式如下：萌發(fā)率(%)＝萌發(fā)的種子數(shù)/(接種的種子數(shù)－污染的種子數(shù)) ×100%；污染率(%)＝污染種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；成苗率(%)＝成苗數(shù)/(接種的種子數(shù)－污染的種子數(shù))×100%；增殖倍數(shù)=增殖后獲得的單芽個(gè)數(shù)/接種的外植體數(shù)；生根率(%)＝生根的苗數(shù)/接種的芽苗數(shù)×100%；平均生根條數(shù)＝每處理生根的總根數(shù)/生根的總苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌處理對香椿種子萌發(fā)和污染情況的影響

由表1可知，A1～A13處理污染率明顯低于A14處理，說明各滅菌材料的不同處理時(shí)間都有滅菌作用，并且各處理的滅菌效果有差異，1%NaClO和0.1%HgCl2處理時(shí)隨著處理時(shí)間的延長，污染率降低，而10%H2O2處理時(shí)并沒有這種趨勢，其中處理A9的污染率最低，為3.33%。A1～A13處理萌發(fā)率明顯低于A14處理，說明滅菌處理對種子萌發(fā)有一定的傷害作用，其中除對照外，處理A12的萌發(fā)率最高，為87.37%。由表1知，相同滅菌時(shí)間下，0.1%HgCl2的滅菌作用要明顯好于1%NaClO和10%H2O2，但0.1%HgCl2處理的種子萌發(fā)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1%NaClO和10%H2O2，并達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。因此，處理A4的滅菌效果最好，即用1%NaClO處理20 min，香椿種子污染率為25.00%，萌發(fā)率為82.32%。

2.2 不同培養(yǎng)基及添加不同GA3濃度對種子萌發(fā)的影響

不同培養(yǎng)基、不同GA3濃度的添加影響種子的初始萌發(fā)時(shí)間、成苗率和幼苗生長狀況，見表2。由表2可知，在同等激素水平下，以WPM和1/2MS作為基本培養(yǎng)基，成苗率差異不顯著（P＞0.05），但都顯著高于MS培養(yǎng)基（P＜0.05）。同一種培養(yǎng)基時(shí)，隨著添加GA3濃度的增加，初始萌發(fā)時(shí)間縮短，但濃度過高會使根系浮在培養(yǎng)基表面，不利于幼苗生長。因此，在WPM或1/2MS培養(yǎng)基上添加3.0 mg·L-1GA3，可以縮短香椿種子萌發(fā)時(shí)間，有利于幼苗生長（B4或B5組）。

表1 不同消毒劑和消毒時(shí)間對香椿種子消毒效果的影響?Table 1 Effect of different disinfection and sterilizing time on seeds of Toona sinensis

表2 不同培養(yǎng)基及添加不同GA3濃度對種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different medium and GA3 concentration on seed germination

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽誘導(dǎo)的影響

由表3可知，在只添加GA3的C1組中，不能誘導(dǎo)出香椿叢芽，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)出的香椿叢芽數(shù)量多而小，生長緩慢。當(dāng)培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA，并附加1.0 mg·L-1的GA3時(shí)，叢芽增殖倍數(shù)達(dá)到4.82，叢芽粗壯，生長旺盛（見圖1C）。隨著6-BA濃度的增加, 叢芽增殖倍數(shù)降低， 并有愈傷產(chǎn)生，不利于后期壯苗培養(yǎng)。因此，適合香椿叢芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：MS＋1.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA＋1.0 mg·L-1GA3（C5組）。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對香椿試管苗壯苗培養(yǎng)的影響

由于叢芽誘導(dǎo)的無菌苗較瘦弱, 進(jìn)行壯苗培養(yǎng)有利于得到健壯芽苗。由表4可知，只添加2.0 mg·L-1GA3的D1組可以促進(jìn)芽苗生長，但芽苗細(xì)弱，添加6-BA和IAA后，芽苗基部都有膨大現(xiàn)象（D2～D7組）。當(dāng)6-BA濃度一定時(shí)，隨著IAA濃度的增加，苗高有所降低，當(dāng)IAA濃度達(dá)到0.5 mg·L-1時(shí)有愈傷產(chǎn)生。當(dāng)6-BA為1.0 mg·L-1時(shí)，芽苗有增殖現(xiàn)象發(fā)生，不利于壯苗培養(yǎng)。因此，香椿無根苗壯苗的最佳培養(yǎng)基為：MS＋0.5 mg·L-16-BA＋0.05 mg·L-1IAA＋2.0 mg·L-1GA3（D2組）。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of plant growth regulators on the induction of cluster buds

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對香椿試管苗壯苗培養(yǎng)的影響Table 4 Effects of different plant growth regulators on seedling culture of Toona sinensis

2.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對生根的影響

由表5可知，當(dāng)培養(yǎng)基中（E1組）沒有添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑，芽苗的生根率和生根條數(shù)都為0。當(dāng)培養(yǎng)基中只添加IBA時(shí)，隨著IBA濃度的增加，生根率和平均生根條數(shù)增大，當(dāng)IBA濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，10 d后有白色根系產(chǎn)生，45 d后生根效果最佳，生根率為78.16%，平均生根條數(shù)為4.8，根系發(fā)達(dá)（見圖1F、1G）。當(dāng)培養(yǎng)基中加入2.0 mg·L-1IBA時(shí)，隨著NAA濃度增加生根率逐漸下降，并且根系分化不明顯，芽苗基部產(chǎn)生愈傷并有玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生，不利于后期煉苗移栽（見圖1H）。因此，MS＋I(xiàn)BA 2.0 mg·L-1為生根的最適培養(yǎng)基（E5組）。將生根45 d的試管苗打開瓶蓋在人工氣候室中煉苗2 d，保持其濕度為65%左右。去掉根部的培養(yǎng)基， 然后移栽到園土∶草炭土∶珍珠巖體積比為2∶2∶1的混合基質(zhì)中，移栽初期保持盆內(nèi)微環(huán)境相對濕度為75%～85%。30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率達(dá)到77.5%（見圖1I）。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對生根的影響Table 5 Effects of plant growth regulators on the percentage of rooting

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)中，菌類污染是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)不同種子選擇合適的消毒材料、消毒時(shí)間是降低組織培養(yǎng)中外植體菌類污染和快速、高效地獲得無菌材料的關(guān)鍵步驟，常用的消毒劑有：酒精，溴水，次氯酸鈉，過氧化氫，升汞，抗生素和高錳酸鉀等，其中升汞被認(rèn)為是目前消毒效果最好的。本試驗(yàn)在對香椿種子滅菌處理時(shí)發(fā)現(xiàn)3種材料都有滅菌的作用。雖然升汞對香椿種子滅菌效果最好，但種子萌發(fā)效果明顯低于次氯酸鈉和雙氧水，這與江濤等[7]在毛竹種子組培滅菌試驗(yàn)中研究結(jié)果一致。培養(yǎng)基對植物組織培養(yǎng)有一定的影響，1/2MS培養(yǎng)基是油桐種胚再生體系建立的較佳培養(yǎng)基[8]。WPM培養(yǎng)基是最適合美國流蘇離體胚萌發(fā)啟動的基本培養(yǎng)基[9]。吳俊長等[10]發(fā)現(xiàn)將珙桐種胚接種于WPM培養(yǎng)基上，外表面2 d后形成少許致密氧化物，些許褐化，后期生長快速。本試驗(yàn)中，1/2MS和WPM培養(yǎng)基對香椿種子的成苗率影響差異不大，但都顯著高于MS培養(yǎng)基，可能原因是MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量高影響種子的萌發(fā)。

增殖倍數(shù)的高低反映了植物快速繁殖的速度和效率，是工廠化育苗時(shí)預(yù)估苗木生產(chǎn)總量的重要指標(biāo)，在叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，6-BA的使用比較常見，但常與其他植物生長調(diào)節(jié)劑一起使用[11]。本試驗(yàn)中，隨著培養(yǎng)基中添加6-BA濃度的升高，香椿芽苗的增殖倍數(shù)呈先增大后減小的趨勢，與大花型紅花蝴蝶蘭組培增殖結(jié)果一致[12]；隨著NAA濃度的增加，芽膨大變形成為綠色半透明的畸形苗，基部出現(xiàn)愈傷并有玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生，與百合科巴迪亞壽組培增殖結(jié)果一致[13]。有學(xué)者研究表明，增殖倍數(shù)過高會引起組培苗的弱化, 生長勢變差[14]。本試驗(yàn)中當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，增殖倍數(shù)顯著高于6-BA濃度為2.0 mg·L-1，但叢芽小，生長緩慢。

由于叢芽誘導(dǎo)的無菌苗較瘦弱，在培養(yǎng)中添加細(xì)胞分裂素和生長素進(jìn)行壯苗，有利于得到健壯芽苗。已有學(xué)者進(jìn)行大量研究，迷人杜鵑在0.5 mol·L-12-ip＋0.1 mol·L-1NAA 的培養(yǎng)基上壯苗效果最佳[15]。堇葉紫金牛的最佳壯苗培養(yǎng)基為1.0 mg·L-1KT＋0.5 mg·L-1NAA[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)培養(yǎng)基中添加較低濃度的6-BA（0.5 mg·L-1）時(shí)，IAA濃度降低更有利于壯苗培養(yǎng)，可能原因是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，芽苗體內(nèi)的激素在逐漸升高，過高的激素對芽苗的生長有抑制作用[17-18]；高濃度的生長素和細(xì)胞分裂素組合會使芽苗增高效果減弱并有愈傷產(chǎn)生，這與田奧磊等在武夷巖茶壯苗生長培養(yǎng)試驗(yàn)中研究結(jié)果一致[19]。在進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)，IBA和NAA是最廣泛應(yīng)用的植物生長調(diào)節(jié)劑。本試驗(yàn)結(jié)果表明：培養(yǎng)基中添加IBA的濃度越高，生根率越高，芽苗根系生長情況越好，這與陳珂在紅椿生根培養(yǎng)試驗(yàn)中結(jié)果一致[20]。當(dāng)IBA濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，隨著NAA激素濃度的提高，生根率降低，根部愈傷組織增多，與晏姝等在南洋楹和郭樹義等在烏腺金絲桃組培生根試驗(yàn)中研究結(jié)果一致[21-22]。

目前，香椿組織培養(yǎng)常以葉片、帶芽莖段為起始外植體，許麗瓊等[5,23]以葉片為起始外植體誘導(dǎo)香椿組培苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，獲得無菌葉片時(shí)容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。梁明勤等[24]以帶芽莖段為起始外植體發(fā)現(xiàn)，在生根培養(yǎng)時(shí)添加1 g·L-1AC 的處理不僅生根率高，而且芽苗粗壯。馬勤[25]研究發(fā)現(xiàn)以帶芽莖段為起始外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)受到取材的限制，其中以6月中旬—7月下旬的當(dāng)年生半木質(zhì)化的非休眠期腋芽莖段為最佳。本研究以種子獲得無菌苗為起始外植體建立香椿的組培快繁技術(shù)體系，可以不受取材時(shí)間的限制，并且以種子為起始外植體誘導(dǎo)的香椿無菌苗，其下胚軸和子葉更易誘導(dǎo)出愈傷組織，可為下一步香椿組織培養(yǎng)的間接發(fā)生體系打下基礎(chǔ)。后續(xù)將對葉片和下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織及其誘導(dǎo)分化成芽這一部分內(nèi)容進(jìn)行研究，為其規(guī)模化生產(chǎn)提供多途徑的技術(shù)依據(jù)。