熒光偏振免疫分析法在小分子藥物小鼠血藥濃度檢測(cè)中的應(yīng)用

劉 洋，劉 艷，劉宸辛，馮志桐，姜 丹

(吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春130021)

小鼠是藥物和疾病模型中常用的模式生物，對(duì)小鼠給藥后的血藥濃度準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)是藥理和藥劑學(xué)研究中必須解決的技術(shù)難題之一。目前在藥理和藥劑學(xué)研究中對(duì)小分子藥物血藥濃度的檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法(HPLC法)。雖然該檢測(cè)方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性均很好，但所用儀器昂貴、檢驗(yàn)成本高、檢驗(yàn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(約3 h)，嚴(yán)重限制了其在快速化、高通量檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用。且當(dāng)血藥濃度處于高濃度(>90 mg·L-1) 時(shí)，柱前衍生化程度存在飽和狀態(tài)，測(cè)定數(shù)據(jù)存在一定偏差[1-3]。因此，急需開發(fā)快速、高通量、靈敏和準(zhǔn)確的血藥濃度檢測(cè)手段。熒光偏振免疫技術(shù)(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)利用熒光偏振原理，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法機(jī)制，常用來(lái)監(jiān)測(cè)小分子物質(zhì)如藥物和激素在樣本中的含量[4]。與HPLC法和質(zhì)譜法比較，F(xiàn)PIA法在測(cè)定小分子溶液在液相介質(zhì)中的濃度方面具有樣本量少、成本低、檢測(cè)速度快和高通量等優(yōu)點(diǎn)[5-7]。本研究將從藥品檢出限、線性檢測(cè)范圍、質(zhì)控分析、日間精密度和雜質(zhì)干擾等多個(gè)方面探討FPIA技術(shù)在3種常見(jiàn)的小分子藥物(慶大霉素、地高辛和丙戊酸鈉)小鼠血藥濃度檢測(cè)中的應(yīng)用效果，為FPIA法在藥理研究中的廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器30只8周齡KM小鼠(雌性，合格證號(hào)：211002300022655)，購(gòu)于吉林省長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。慶大霉素?zé)晒馄衩庖叻治鲈噭┖?77404)、地高辛熒光偏振免疫分析試劑盒(86859)和丙戊酸鈉熒光偏振免疫分析試劑盒(67439)(美國(guó)雅培制藥有限公司)，慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(130326-200314)、地高辛標(biāo)準(zhǔn)品(100015-200709)和丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(100963-201101)(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。多功能酶標(biāo)儀(Synergy2，美國(guó)伯騰儀器有限公司)。

1.2 FPIA法檢測(cè)藥物濃度的檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線配制0、1、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000和10 000 μg·L-1藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度，測(cè)定熒光偏振(FP)值并做非線性回歸分析。以0 μg·L-1樣本的FP值為IC0,以10 000 μg·L-1樣本的FP值為IC100，計(jì)算慶大霉素、地高辛和丙戊酸鈉在當(dāng)前檢測(cè)條件下的檢出限(IC10)及FP值的線性變化范圍(IC20～I(xiàn)C80)[8]。

在線性范圍內(nèi)選取12個(gè)線性濃度梯度位點(diǎn)(慶大霉素50～390 μg·L-1，地高辛80～520 μg·L-1，丙戊酸鈉18～128 μg·L-1)，配置標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液，測(cè)定FP值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸分析，以r2值作為標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 FPIA法檢測(cè)藥物濃度的質(zhì)控分析對(duì)每種待測(cè)藥品設(shè)置3組質(zhì)控液，分別為高濃度組、中濃度組和低濃度組，每組質(zhì)控液包含6個(gè)質(zhì)控樣本，每組質(zhì)控樣本的平均藥物濃度已知。采用FPIA法分別測(cè)定各質(zhì)控組樣本的偏振光強(qiáng)度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的藥物濃度和每組質(zhì)控組的平均濃度。將FPIA法測(cè)定得出的質(zhì)控組平均濃度與已知的平均濃度進(jìn)行比較，誤差百分比(ER) <5%為合格標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 FPIA法檢測(cè)藥物濃度的日間精密度分析3組質(zhì)控液中各取1個(gè)質(zhì)控樣本，連續(xù)20 d每天用FPIA法測(cè)定1次樣本血藥濃度。計(jì)算20 d所測(cè)數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)，以此評(píng)價(jià)該檢測(cè)方案的日間精密度。以CV<8%為合格標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 FPIA法檢測(cè)小鼠血藥濃度的準(zhǔn)確度分析小鼠摘眼球取血，4 000 r·min-1離心5 min收集血清。在3種藥品的中濃度組質(zhì)控液中分別添加不同體積濃度(5%、20%和50%)小鼠血清，血清加入后FPIA法檢測(cè)藥物濃度的偏差值。以偏差值 <10%為合格標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 FPIA法檢測(cè)小鼠血藥濃度30只小鼠分為3組，每組10只，采用3種藥物分別對(duì)每組小鼠進(jìn)行一次性給藥操作，其中慶大霉素肌肉注射5 μg·g-1，地高辛灌胃20 ng·g-1，丙戊酸鈉灌胃15 μg·g-1。在給藥后 1 、3 、6 、12和24 h對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶取血(取血量約0.1 mL)，血液樣本用超純水稀釋50～100倍后用于FP值測(cè)定，結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度。

2 結(jié) 果

2.1 藥物濃度的檢出限和標(biāo)準(zhǔn)曲線待測(cè)藥品在0～10 000 μg·L-1范圍內(nèi)的FP值變化曲線見(jiàn)圖1。數(shù)據(jù)點(diǎn)經(jīng)非線性擬合處理后， IC10和IC20～I(xiàn)C80測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。3種藥物的檢出限均在50 μg·L-1以下，線性范圍較寬(大于10倍檢出限)，在當(dāng)前檢測(cè)環(huán)境下可對(duì)3種藥品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和濃度測(cè)定。

A：Gentamycin；B: Digoxin；C: Sodium valproate.

表1 FPIA法檢測(cè)3種藥品檢出限和線性范圍

在線性范圍內(nèi)選取12個(gè)線性濃度梯度位點(diǎn)，配置標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液，測(cè)定FP值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，3種藥品的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量均較好，線性回歸的r2值均在0.99以上，可以用于濃度測(cè)定。

2.2 FPIA法檢測(cè)藥物濃度準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性 用FPIA法檢測(cè)3組質(zhì)控液的6個(gè)樣本后計(jì)算平均值和ER，見(jiàn)表2。3種藥品在不同濃度質(zhì)控液中的檢測(cè)準(zhǔn)確度均符合要求， ER均在5%以下。對(duì)同一待測(cè)樣本進(jìn)行連續(xù)20 d的日間精密度分析，在低濃度條件下FPIA法檢測(cè)的日間精密度較差，3種藥品的檢測(cè)CV均大于8%，還需進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)條件以達(dá)到日間精密度標(biāo)準(zhǔn)。在中濃度和高濃度條件下，F(xiàn)PIA法檢測(cè)的日間精密度符合標(biāo)準(zhǔn)，3種藥品的檢測(cè)CV均小于5%。見(jiàn)表3。

表2 FPIA法檢測(cè)3種藥品的準(zhǔn)確度

表3 FPIA法檢測(cè)3種藥品的日間精密度

2.3 加入不同體積濃度小鼠血清后FPIA法檢測(cè)3種藥物濃度的準(zhǔn)確度 在中濃度質(zhì)控液中加入不同體積濃度小鼠血清后，F(xiàn)PIA法檢測(cè)的準(zhǔn)確度見(jiàn)表4。小鼠血清的存在對(duì)慶大霉素和地高辛的FPIA檢測(cè)效果無(wú)明顯影響，其ER在5%以內(nèi)且無(wú)明顯的血清濃度依賴性。在對(duì)丙戊酸鈉的檢測(cè)中，小鼠血清對(duì)FP值有明顯的負(fù)向影響，尤其是在高濃度血清存在時(shí)(50%血清)檢測(cè)誤差明顯升高，ER在10%以上，因此在檢測(cè)小鼠丙戊酸鈉血藥濃度時(shí)應(yīng)重新優(yōu)化抗體的選擇和檢測(cè)條件，或者對(duì)血液樣本做稀釋處理以控制血清對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確度的影響。

表4 加入不同體積濃度小鼠血清后FPIA法檢測(cè)3種藥品的準(zhǔn)確度

2.4 FPIA法檢測(cè)小鼠血藥濃度 根據(jù)3種藥物在相關(guān)疾病治療中的建議給藥量及代謝特性，設(shè)計(jì)了FPIA法檢測(cè)小鼠血藥濃度測(cè)試的給藥量及采血時(shí)間點(diǎn)。小鼠血液樣本經(jīng)稀釋后測(cè)定血藥濃度。慶大霉素的血藥濃度峰值出現(xiàn)在給藥后1 h左右，藥物半消期在3 h左右；地高辛的血藥濃度峰值出現(xiàn)在給藥后1 h左右，藥物半消期在24 h以上；丙戊酸鈉的血藥濃度峰值出現(xiàn)在給藥后3 h左右，藥物半消期在6～12 h 。見(jiàn)表5。

表5 FPIA法測(cè)定3種藥品不同給藥時(shí)間點(diǎn)小鼠血藥濃度

A：Gentamycin；B: Digoxin;C:Sodium valproate.

3 討 論

FPIA技術(shù)在小分子物質(zhì)檢測(cè)方面具有廣泛的應(yīng)用空間[9-12]。以藥物檢測(cè)為例，以熒光素標(biāo)記的藥物和含待測(cè)藥物的樣本為抗原，與一定量的抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。熒光標(biāo)記的藥物在環(huán)境中旋轉(zhuǎn)時(shí)，偏振熒光的強(qiáng)度與其受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比。大分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)慢，發(fā)出的偏振熒光強(qiáng)；小分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)快，其偏振熒光弱(去偏振現(xiàn)象)[13-15]。因此，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合過(guò)程中，樣本中待測(cè)藥物越多，與抗體結(jié)合的標(biāo)志抗原就越少，抗原抗體復(fù)合物體積越大，旋轉(zhuǎn)速率越慢，從而激發(fā)的FP值越低[16]。當(dāng)確定了已知濃度的標(biāo)記抗原與FP值的關(guān)系后，就可以測(cè)量未知濃度的物質(zhì)。因此，F(xiàn)PIA法可用來(lái)檢測(cè)環(huán)境或食品樣品中有毒物質(zhì)如農(nóng)藥的殘留量[17-19]。此外，臨床醫(yī)學(xué)診斷也廣泛采用FPIA法[20-21]。FPIA法除可測(cè)定人體體液樣本中某一特定物質(zhì)的水平外，也可直接應(yīng)用于臨床診斷。Cercek 等[22]對(duì)惡性腫瘤診斷方法的研究顯示：進(jìn)入淋巴細(xì)胞的熒光物質(zhì)，受胞漿濃度有序性的干擾，其運(yùn)動(dòng)方向和速率會(huì)發(fā)生變化。胞漿黏度高時(shí)，熒光物質(zhì)運(yùn)動(dòng)變慢，受偏振光激發(fā)產(chǎn)生的激發(fā)光與胞漿黏度低時(shí)產(chǎn)生的激發(fā)光性質(zhì)不同。通過(guò)追蹤測(cè)定激發(fā)的偏振光性質(zhì)，即可了解淋巴細(xì)胞的胞漿流動(dòng)性和黏度等環(huán)境的變化，結(jié)合其他輔助診斷方法，可有助于癌癥的早期診斷[22-23]。利用FPIA法還可檢測(cè)患者樣本中病毒 DNA 如 HBV、 HPV 的復(fù)制量，為臨床診斷提供有力的量化指標(biāo)。本文作者探討FPIA法在小鼠血藥濃度檢測(cè)中的應(yīng)用效果，測(cè)定了FPIA法檢測(cè)血藥濃度的線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)檢測(cè)的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性進(jìn)行了全面的考察。本研究建立和優(yōu)化的3種藥品的FPIA法血藥濃度檢測(cè)方案在小鼠給藥實(shí)驗(yàn)中能夠準(zhǔn)確、有效地監(jiān)測(cè)藥物代謝變化，具有樣本需求量少、無(wú)預(yù)處理、檢測(cè)快速和高通量等優(yōu)點(diǎn)。采用FPIA法檢測(cè)得到的3種藥物代謝數(shù)據(jù)與已知報(bào)道[24-26]相符。該方案的建立為今后FPIA法在藥理實(shí)驗(yàn)和臨床檢測(cè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。