尼可地爾對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡的影響

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Rubler等[1]于1972年發(fā)現(xiàn)，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種與糖尿病病人體內(nèi)代謝紊亂有關(guān)的獨特心肌病變，不伴有高血壓、冠狀動脈粥樣硬化、心臟瓣膜病等心臟疾病。包括心肌細(xì)胞代謝紊亂、微血管病變引起的心臟病變。近年來研究表明，DCM對人類健康的威脅日益嚴(yán)重，是引起糖尿病病人死亡的重要合并癥之一，病人生活質(zhì)量也受到嚴(yán)重影響，因此，早期治療對降低DCM病人死亡率有重要意義[2]。本研究觀察鉀離子通道開放劑尼可地爾對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡的影響，為糖尿病心肌病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠 40只雄性健康SD大鼠，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(軍)2012-0004，體質(zhì)量150 g～170 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 主要藥物及試劑 尼可地爾購自中外制藥株式會社、格列本脲購自天津太平洋制藥有限公司，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、HE染色試劑盒、核酸末端標(biāo)記法(TUNEL法)試劑盒、天狼星紅染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 Olympus BX53光學(xué)顯微鏡；羅氏全自動生化分析儀Cobas 8000 c702。

1.4 糖尿病心肌病大鼠模型的建立， 以健康的SD雄性大鼠8只作為正常對照組(A組)，另取健康的SD雄性大鼠32只作為實驗組，將實驗組大鼠隨機(jī)分為4組：糖尿病心肌病模型組(B組)、尼可地爾干預(yù)組(C組)、格列本脲干預(yù)組(D組)、尼可地爾+格列本脲干預(yù)組(E組)，每組8只。A組給予普通飼料喂養(yǎng)6周，B組、C組、D組、E組大鼠均予高脂高糖飼料(10%豬油、蔗糖20%、2%膽固醇、1%膽鹽、67%普通飼料)喂養(yǎng)6周后，給予腹腔注射40 mg/kg鏈脲佐菌素(溶于0.1 mol/L pH4.2的枸櫞酸緩沖液中，3 d后，禁食12 h，觀察大鼠出現(xiàn)多尿、多飲、多食且尾靜脈取血測血糖值>16.7 mmol/L者成模[3-5]。繼續(xù)喂養(yǎng)，第8周開始，實驗組分別予不同的干預(yù)，B組干預(yù)措施為連續(xù)28 d 生理鹽水4 mL/kg灌胃1次/日，C組為連續(xù)28 d尼可地爾 10 mg/kg灌胃1次/日，D組為連續(xù)28 d格列本脲 5 mg/kg灌胃1次/日， E組為連續(xù)28 d尼可地爾10 mg/kg 1次/日+格列本脲5 mg/kg灌胃1次/日。

1.5 制備組織標(biāo)本及觀察生化指標(biāo) 12周后，每組大鼠均腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，心臟取血用于化驗各項生化指標(biāo)。用生理鹽水反復(fù)沖洗迅速取出完整新鮮心臟，濾紙吸干，稱重，分離左心室，浸入甲醛中，24 h后石蠟包埋。用HE染色法觀察心肌組織學(xué)變化及纖維化程度，TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、天狼星紅染色法觀察Ⅰ型/Ⅳ型膠原蛋白比例。羅氏全自動生化分析儀Cobas 8000 c702測定血糖、血脂水平，包括空腹血糖(FBG)、 總膽固醇(TG)、三酰甘油(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。采用己糖激酶法測定血糖情況，采用常規(guī)酶法測定TG和TC，采用直接法測定HDL-C 和 LDL-C。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況 對照組大鼠飲食、飲水量正常，尿量正常，毛色鮮亮，精神尚佳，情緒穩(wěn)定，反應(yīng)靈敏；實驗組大鼠均出現(xiàn)不同程度的多食、多飲、多尿，且有毛色枯黃、體形消瘦、煩躁、嗜睡的癥狀。

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)結(jié)果比較(見表1)

mmol/L

2.3 HE染色觀察心肌纖維化程度 A組可見心肌纖維走行正常，心肌細(xì)胞呈規(guī)整排列，核居細(xì)胞中央，呈完整的圓形或橢圓形，胞漿均勻著色，間質(zhì)及微血管也未見異常；B組、C組、D組、E組心肌纖維走行紊亂，可見壞死、斷裂的心肌纖維，核裂解及核溶解也有不同程度地出現(xiàn)，心肌細(xì)胞呈空泡狀，界限不清，同時可見炎細(xì)胞浸潤、纖維細(xì)胞增生。其中 B組最為明顯，C組較其他各組纖維細(xì)胞增生程度最不明顯。詳見圖1。

圖1 HE染色后心肌纖維化程度(HE×200)

2.4 TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 正常心肌細(xì)胞核在光鏡下為藍(lán)色，形態(tài)、大小較為一致；而凋亡的心肌細(xì)胞核可見核濃縮、聚集，為黃褐色，著色深淺不一，大小不一。各組間心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2、表2。

組別n凋亡指數(shù)A組80．89±0．01B組80．92±0．03C組80．92±0．01D組80．93±0．01E組80．97±0．00

圖2 TUNEL法觀察心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)

2.5 天狼星紅染色法觀察Ⅰ型/Ⅳ型膠原蛋白比例 光鏡下可見Ⅰ型膠原纖維呈亮紅色，Ⅳ型膠原纖維呈綠色。對照組大鼠有較均勻、纖細(xì)的膠原纖維分布，還可見大部分變窄的心肌細(xì)胞束間隙。實驗組大鼠心肌橫切面，可見膠原纖維粗大、紊亂，排列成網(wǎng)。而尼可地爾干預(yù)組膠原纖維較其余模型組分布均勻。詳見圖3。

圖3 天狼星紅染色法觀察Ⅰ型/Ⅳ型膠原蛋白比例

3 討 論

糖尿病心肌病是一種與冠心病、瓣膜病無關(guān)的、獨立的特異性心肌病變。近年來研究表明，糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制包括多個非常復(fù)雜的方面，如心肌細(xì)胞代謝障礙、心肌微血管病變、胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)異常、細(xì)胞因子異常、氧自由基異常等[6]。目前大多數(shù)研究結(jié)果表明，早期DCM主要由以下幾方面引起，包括：心肌能量代謝紊亂、高血糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡、線粒體損傷等[7-8]。文獻(xiàn)報道，DCM會發(fā)生一些病理改變，如心肌肥大、微血管變窄、膠原結(jié)構(gòu)改變、心肌纖維化[9]及心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，B組、C組、D組、E組與正常對照組(A組)相比，心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的病理組織學(xué)改變。

本研究先以高脂高糖飲食喂養(yǎng)實驗組大鼠，造成其糖脂代謝異常，再給予大鼠腹腔注射STZ，結(jié)果顯示實驗組與對照組相比，F(xiàn)BG、 TG、TC、LDL-C均偏高，表明實驗組大鼠符合2型糖尿病特點，有胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂；而機(jī)體高血糖狀態(tài)可使心肌細(xì)胞Na+-K+-ATP酶的活性受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+蓄積[10]，出現(xiàn)舒張功能障礙。而KATP通道可被尼可地爾激活，使K+導(dǎo)電性增強(qiáng)，從而K+外流增多，膜電位超極化，導(dǎo)致電壓依賴性Ca2+通道的關(guān)閉，減少Ca2+的內(nèi)流，使Na+-Ca2+交換增加，降低了心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[11]，起到了心肌保護(hù)作用。

尼可地爾是分子式中含有硝酸基的ATP敏感的KATP開放劑。它一方面通過直接激活cGMP，使得細(xì)胞膜和線粒體膜KATP的開放增加，具有舒血管的效應(yīng)，從而增加狀動冠脈血流，改善血管痙攣和微循環(huán)；另一方面還可以使鉀離子存留到線粒體內(nèi)，抑制了鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯降低，進(jìn)而起到舒張血管、改善冠狀動脈血流的功效，很大程度上減輕了心臟前后負(fù)荷[12-16]，同時在抗心肌細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)缺血預(yù)適應(yīng)方面，尼可地爾也有一定作用。本實驗研究結(jié)果顯示：尼可地爾干預(yù)組天狼星紅染色法觀察可見膠原纖維分布均勻，HE染色法可見心肌纖維化程度較糖尿病心肌病模型組輕，表明尼可地爾具有減輕糖尿病大鼠的心肌損傷作用。本研究中尼可地爾組與其他各組相比，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)之間的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義，分析可能的原因有：①用于實驗的樣本量不夠大，故有待觀察較大樣本量的細(xì)胞凋亡指數(shù)。②與尼可地爾的劑量較小有關(guān)，抗心肌細(xì)胞凋亡效果不顯著。③實驗后期大鼠老齡化，心肌細(xì)胞本身也發(fā)生了凋亡。

本研究表明，尼可地爾可減輕糖尿病大鼠的心肌損傷及心肌纖維化，可為早期糖尿病心肌病的心肌保護(hù)提供依據(jù)，有重要的臨床應(yīng)用價值。