新型導(dǎo)電復(fù)合材料聚吡咯殼聚糖對新生大鼠心室肌細(xì)胞鈣信號傳導(dǎo)的影響及可能機(jī)制

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在世界范圍內(nèi)，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease，CHD)是引起心肌梗死(myocardial infarction，MI)、導(dǎo)致心力衰竭(heart failure，HF)發(fā)生的主要原因[1]，其致死率、致殘率依然處于第一位，給個人、家庭、社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重威脅人類健康[2-4]。心肌梗死及其導(dǎo)致的心力衰竭治療一直是臨床工作的重點和難點；改善心臟功能、延緩心力衰竭等終末期心臟病的發(fā)生逐漸得到心血管專家的共識[5]。心肌梗死后大量心肌細(xì)胞死亡，由于心臟自身的再生能力限制，梗死及其周邊區(qū)域被瘢痕組織取代，引起健康心肌組織與瘢痕組織缺乏正常的電信號通路，導(dǎo)致心臟電信號傳播異常、不同步的心臟活動和收縮，最終發(fā)展為心力衰竭[6]。如何在治療心肌梗死同時改善該部位電傳導(dǎo)，越來越得到醫(yī)學(xué)界的重視。有學(xué)者將導(dǎo)電聚合物注射到動物心肌梗死部位，觀察到心律失常的次數(shù)及嚴(yán)重程度有所降低[7-8]。

聚吡咯具有金屬和半導(dǎo)體特性，在神經(jīng)系統(tǒng)和骨關(guān)節(jié)中已經(jīng)開展了相關(guān)研究[9-10]；在心血管系統(tǒng)還未有報道。本研究旨在探討聚吡咯殼聚糖(polypyrrole-chitosan，Ppy-Chi)對新生大鼠心室肌細(xì)胞(NRVM)的鈣介導(dǎo)電傳導(dǎo)速率的影響及作用機(jī)制，明確其生物安全性，評估是否能作為心臟植入材料的候選材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 98%吡咯、低分子殼聚糖(Chi)、甘油磷酸二鈉、25%戊二醛、六水三氯化鐵、胰酶、DAPI、SARC抗體、Cx-43抗體(美國Sigma公司)；Ⅱ型膠原酶(加拿大Worthington公司)；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12、Fluo-4(美國Gibco公司)；Percoll分離液(美國GE公司)；新生大鼠[山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SYXK(晉)2015-001]。

1.2 方法

1.2.1 Ppy-Chi合成 2 g Chi溶于50 mL濃度為0.18 mol/L醋酸溶液中，400RPM攪拌2 h后，300 μL純度為98% Pyrrole在攪拌的同時緩慢加入，攪拌過夜；加入5 mL含有0.9 g三氯化鐵溶液，40 ℃旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下反應(yīng)48 h，0.1× PBS 溶液透析3次，去除多余的鐵離子及吡咯單體；50%甘油磷酸鈉調(diào)整Ppy-Chi溶液pH值至6左右，取500 μL Ppy-Chi溶液加入適量0.4%戊二醛溶液后，在細(xì)胞培養(yǎng)皿上形成均勻涂層，備后續(xù)實驗用，2% Chi溶液作為對照材料。

1.2.2 Ppy-Chi近紅外光譜分析 制成1 mm厚Ppy-Chi、Chi薄膜，用瑪瑙研磨體充分研磨，置于測試臺上，10 T/cm2加壓3 min，應(yīng)用紅外光譜儀(Nicolettm iStm 50，美國賽默飛公司)對上述樣品進(jìn)行測量(分辨率4/cm，掃描64次)。通過系統(tǒng)自帶軟件繪制近紅外光譜圖，通過特征譜線分析材料組分。

1.2.3 新生大鼠NRVM分離及鑒定 采用復(fù)合酶液法分離新生大鼠心室肌細(xì)胞，通過Percoll液密度梯度離心法純化NRVM，按0.5×106/cm2濃度接種在空白培養(yǎng)皿、Phi-Chi培養(yǎng)皿、Chi培養(yǎng)皿中，在37℃，5%CO2和95%空氣中培養(yǎng)；5 d后固定行SARC、Cx-43免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)拍照觀察。

1.2.4 Ppy-Chi導(dǎo)電復(fù)合材料的生物相容性 將成功分離的NRVM細(xì)胞按0.5×106/cm2密度接種在空白培養(yǎng)皿、Phi-Chi培養(yǎng)皿、Chi培養(yǎng)皿中，分別在第1天、第5天時通過DAPI染色進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)(n=3)。

1.2.5 NRVM鈣介導(dǎo)的電信號傳導(dǎo)速率檢測 將NRVM在Phi-Chi培養(yǎng)皿、Chi培養(yǎng)皿中共培養(yǎng)5 d后，PBS洗滌3次，用5 mmoL/L Fluo-4標(biāo)記30 min，再次洗滌去除多余Fluo-4染料，置于高速電子倍增耦合成像系統(tǒng)(Evolve128，美國Photometrics公司)中檢測，激發(fā)光488 nm，放大率0.6，記錄3 s視頻，約1 500幀圖像；應(yīng)用Image J(Version 1.51w 13，美國NIH提供)分析，在Phi-Chi、Chi記率的視頻中選取兩個距離相等的感興趣區(qū)，觀察二者之間鈣介導(dǎo)的電傳導(dǎo)信號傳遞需要的時間，計算二者間電傳導(dǎo)率(n=3)。

1.2.6 Ppy-Chi導(dǎo)電性測定 添加不同濃度戊二醛溶液將Ppy-Chi、Chi在培養(yǎng)皿中形成相同厚度水凝膠，置于半導(dǎo)體導(dǎo)電率測試臺(HP4155，美國惠普公司)上，用兩探針循環(huán)伏安法測定材料導(dǎo)電率，兩探針間距7 mm，擇雙線性Sweep模式，按電壓范圍設(shè)定為(-5～5)V，間隔100 mV，Conpline 10 mA，持續(xù)時間2 s，延遲100 μs設(shè)定測量，每一個樣品在不同位置測量3次，用設(shè)備自帶軟件繪制每種材料V-A曲線，選取在曲線起始端近視成直線的點，求出其斜率，按公式計算出導(dǎo)電率，每個樣本取3次測量的平均值納入統(tǒng)計(n=3)。

2 結(jié) 果

2.1 Ppy-Chi導(dǎo)電材料的大體視圖及化學(xué)組成 應(yīng)用單電子氧化還原劑三氯化鐵可以將單體吡咯與殼聚糖形成聚合物Ppy-Chi，具體合成原理詳見圖1-A，聚吡咯結(jié)合在殼聚糖-CH2O-或-NH-基團(tuán)上；應(yīng)用FTIR紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)，在950/cm、1 064/cm可以觀察到N-C、C-O-C二者的特征頻率，在1 654/cm可以觀察到N-H鍵的存在，證明材料合成成功(見圖1-B)；2% Chi為微黃透明溶液，Ppy-Chi為黑色溶液(見圖1-C)；加入適量0.4%戊二醛可與使Ppy-Chi在室溫下形成凝膠(見圖1-D)。

A為 Ppy-Chi合成示意圖，B為Ppy-Chi和Chi的FTIR光譜圖，C為Chi、Ppy-Chi液體狀態(tài)大體視圖，D為Ppy-Chi形成凝膠大體觀。

2.2 NRVM分離及鑒定 應(yīng)用Collagenase TypeⅡ，Trypsin，DNase混合酶體系和PecoⅡ分離液能夠從第一天新生乳鼠得到高純度NRVM，將其培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/F-12完全培養(yǎng)基中；第3天，光鏡下觀察到，細(xì)胞成簇狀生長，可見多個凸起，并與相鄰細(xì)胞相連接，并能表現(xiàn)出節(jié)律性跳動(見圖2-A)。將純化的NRVM接種在空白培養(yǎng)皿中、含有Chi涂層的培養(yǎng)皿和含有Ppy-Chi涂層的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)5 d后，進(jìn)行心肌細(xì)胞標(biāo)記物染色發(fā)現(xiàn)，在上述3種培養(yǎng)四表面，NRVM都能正常表達(dá)心肌標(biāo)記物SARC和Cx-43(見圖2-B)，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

A為大鼠NRVM細(xì)胞原代培養(yǎng)3 d后明場照片(×40)；B為 SARC和Cx-43免疫熒光染色觀察NRVM在3種培養(yǎng)表面的表達(dá)情況(紅色SARC，綠色Cx-43，藍(lán)色細(xì)胞核DAPI； ×600)。

2.3 Ppy-Chi導(dǎo)電復(fù)合材料的生物相容性 將相同數(shù)量NRVM分別培養(yǎng)于空白、Chi、Ppy-Chi涂層的培養(yǎng)皿中(n=6)，于第1天、第5天DAPI標(biāo)記細(xì)胞核后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量(見圖3-A)，每個時間點選取3個樣本，每個樣本在高倍鏡下選取3個視野進(jìn)行統(tǒng)計；發(fā)現(xiàn)在第1天、第5天培養(yǎng)過程中，3種培養(yǎng)表面數(shù)量變化不明顯，且3種培養(yǎng)表面之間NRVM數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖3-B)，證實含有Chi、Ppy-Chi涂層的培養(yǎng)表面與常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)皿有良好的生物相容性。

A為DAPI標(biāo)記NRVM在空白、Chi、Ppy-Chi涂層的培養(yǎng)皿培養(yǎng)情況(×40)；B為在培養(yǎng)1 d、5 d時3種培養(yǎng)表面上NRVM數(shù)量變化不明顯。

2.4 Ppy-Chi導(dǎo)電復(fù)合材料對大鼠NRVM電信號傳導(dǎo)影響 與培養(yǎng)在Chi涂層上NRVM Ca2+介導(dǎo)的電傳導(dǎo)率相比，Ppy-Chi組電傳導(dǎo)率是前者的3倍[11.82±1.45)mm/s與(37.74±13.3)mm/s]。詳見圖4。

A為大鼠NRVM Chi、Ppy-Chi材料表面電信號傳導(dǎo)隨時間變化圖；B為NRVM在Chi、Ppy-Chi表面電信號傳導(dǎo)速度。

2.5 Ppy-Chi導(dǎo)電復(fù)合材料導(dǎo)電率 將Chi、Ppy-Chi在35 mm培養(yǎng)皿中形成厚度為5 mm凝膠，按圖5-A示方法置于半導(dǎo)體測試儀工作臺上，兩探針間距7 mm，應(yīng)用循環(huán)伏安法測試材料阻抗；圖5-B示，Chi、Ppy-Chi兩種材料導(dǎo)電率明顯不同，Chi導(dǎo)電率為(18.21 ±6.13)×10-5S/cm， Ppy-Chi導(dǎo)電率(89.27±16.97)×10-5S/cm。后者約為前者的4倍，證實Ppy-Chi具有優(yōu)良導(dǎo)電性能。詳見圖5-B。

A為檢測方法示意圖；B為Ppy-Chi、Chi導(dǎo)電率。

圖5 Ppy-Chi、Chi導(dǎo)電率比較

3 討 論

由于成人心肌細(xì)胞僅有微弱的再生能力，耐低氧能力差，當(dāng)心臟冠狀動脈血管發(fā)生栓塞時，所供應(yīng)區(qū)域的心肌細(xì)胞大部分發(fā)生凋亡，被瘢痕組織取代，殘存的心肌細(xì)胞形成孤島；由于瘢痕組織與正常心肌組織電阻抗不同，殘存心肌孤島不能進(jìn)行有效電信號傳遞，將發(fā)生不同類別的心律失常，引起心臟功能受損。已有研究表明通過注射生物材料可以改善心臟功能，延緩心力衰竭的發(fā)生[11-12]。由于本研究中注射的生物材料導(dǎo)電性弱，改善心臟電活動效果不明顯，限制了其有效性和使用范圍。

在可注射生物材料中添加一種導(dǎo)電聚合物來改善心臟電生理活動成為一種有益的嘗試，通過增強(qiáng)瘢痕組織的電傳導(dǎo)性，將孤立心肌團(tuán)鏈接起來，實現(xiàn)同步收縮，進(jìn)而縮短QRS間期，使心臟心電圖趨于正常。有學(xué)者對多種導(dǎo)電聚合物在生物組織工程領(lǐng)域開展了深入研究，主要包括Ppy、聚苯胺(Polyaniline，PANI)、聚乙烯二氧噻吩[Poly(3，4-ethylenedioxythiophene)，PEDOT]、聚噻吩(Polythiophene，PTh)、聚乙烯(Polyacetylene，PAc)、聚呋喃(Polyfuran，PFu)等[7，13]。而Ppy由于合成相對容易，導(dǎo)電率高，因此研究相對廣泛。有研究表明基于Ppy導(dǎo)電復(fù)合材料能夠增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附和生長，介導(dǎo)電信號對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激作用[14]。然而，Ppy對脆弱的心肌細(xì)胞能否表現(xiàn)出良好生物相容性和介導(dǎo)心肌細(xì)胞間電信號傳遞還不清楚，需要深入探討。

本研究通過氧化還原法合成了基于Ppy導(dǎo)電聚合物Ppy-Chi，用FTIR證實材料合成成功；用復(fù)合酶化學(xué)消化法和Percoll密度梯度離心法相結(jié)合，能夠分離出高純度NRVM；與空白培養(yǎng)皿和Chi涂層表面相比較，NRVM數(shù)量和心肌標(biāo)記蛋白SARC、Cx-43比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而鈣介導(dǎo)的心肌細(xì)胞電傳導(dǎo)速度明顯快于Chi組；通過對材料導(dǎo)電率分析發(fā)現(xiàn)，Ppy-Chi導(dǎo)電率是Chi的4倍，可能是電信號在高導(dǎo)電率材料Ppy-Chi上傳導(dǎo)較快于高阻抗Chi。

體外研究證實Ppy-Chi與NRVM具有良好的生物相容性，不影響心肌細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，能夠加快心肌細(xì)胞間電信號傳導(dǎo)，是較為理想的心臟可注射生物材料。本研究仍存有不足，如未能闡明Ppy-Chi是通過何種機(jī)制促進(jìn)心肌細(xì)胞間鈣介導(dǎo)的電信號傳導(dǎo)、材料物理電化學(xué)屬性如何轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生物電信號、在大鼠心肌梗死模型中應(yīng)用的效能評價等，這將成為課題組將來研究的切入點。