應(yīng)用離子色譜技術(shù)對胃癌患者尿液游離氨基酸進行代謝譜分析

洪靜 馮珍

摘 要 目的：本實驗通過檢測胃癌患者和正常人尿液中游離氨基酸代謝譜，篩選出具有診斷意義的氨基酸，并探討胃癌患者尿液氨基酸代謝變化的規(guī)律和意義。方法：留取晨尿162例分3組，采用離子色譜法檢測3組尿液中22種氨基酸，應(yīng)用色譜軟件，構(gòu)建尿液氨基酸代謝譜，對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果：胃癌組尿液氨基酸代謝譜較正常組有明顯變化；不同分期胃癌組的氨基酸代謝譜也存在差異。結(jié)論：異亮氨酸等6種氨基酸可能是參與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞增殖和基因表達的重要代謝產(chǎn)物；異亮氨酸和纈氨酸在早期胃癌中可能是重要的代謝產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞 胃癌 早期診斷 代謝組學(xué) 離子色譜 游離氨基酸

中圖分類號：R735.2 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）11-0051-04

Analysis of free amino acid metabolic profiling in urine of gastric cancer patients by ion chromatography

HONG Jing*， FENG Zhen

（Department of Gastroenterology， the Central Hospital of Xuhui District， Shanghai 200031， China）

ABSTRACT Objective： To screen out amino acids with diagnostic significance by detection of metabolic profiling of free amino acids in urine samples of both patients with gastric cancer at different stages and healthy people and to explore the regularity and significance of the changes of amino acid metabolic profiling. Methods： One hundred and sixty-two urine samples were collected and divided into 3 groups. Twenty-two amino acids in each urine sample were detected by ion chromatography（IC） and then the metabolic profiling of amino acids in the urine sample was established with Peaknet 6 software and the obtained data were statistically analyzed. Results： There existed significant differences between patients with gastric cancer and healthy people and even the patients at different stages in metabolic profiling of free amino acids in urine. Conclusion： Six amino acids including isoleucine， valine， leucine， methionine， histidine and aspartic acid may be important metabolites involved in cell proliferation and gene expression during tumor growth and metastasis and isoleucine and valine may also be important metabolites in early gastric cancer.

KEy WORDS gastric cancer； early diagnosis； metabolomics； ion chromatography； free amino acids

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，是全球第二大癌癥致死性疾病[1]。早期胃癌缺乏特異性癥狀，診斷十分困難[2]。臨床上發(fā)現(xiàn)的胃癌多數(shù)已處于進展期，病死率高，嚴(yán)重危害人民健康[3]。然而胃癌病因尚未完全明確，在缺乏有效的一級預(yù)防情況下，二級預(yù)防中的早期診斷就顯得尤為重要。目前內(nèi)鏡結(jié)合活組織病理檢查的診斷方法雖然較為成熟，但診斷準(zhǔn)確率尚有賴于內(nèi)鏡醫(yī)師的經(jīng)驗，且在人口眾多的我國，普查難以符合國情，因此尋求更加方便和簡單的胃癌早期診斷方法意義重大。近年來，代謝組學(xué)的飛速發(fā)展給胃癌的診斷提出了新的思路[4-5]。代謝組學(xué)旨在運用各種先進的檢測技術(shù)對腫瘤患者體內(nèi)的小分子代謝產(chǎn)物進行定性和定量分析，試圖找出更有診斷價值的生物標(biāo)志物[6-9]。本實驗通過檢測不同分期胃癌患者尿液中游離氨基酸代謝輪廓，將其與正常人相比較，篩選出可能具有診斷意義的氨基酸。

1 材料和方法

1.1 儀器

Dionex ICS-3000離子色譜儀、Peaknet 6 色譜工作站（ Thermo Fisher Scientific 公司）；1-15k 3K-15低溫冷凍離心機、TYPE B2生物安全柜（美國Sigma公司）；BDC-280e冷藏冰箱（伊來克斯公司）；XW-80A旋渦振蕩器（上海青浦瀘西儀器廠）；K10CD干式恒溫器 （杭州藍(lán)焰科技有限公司）；ZXC紫外消毒車（上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠）；JA1203N電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

20種氨基酸對照液、鳥氨酸（99.5%）和胱氨酸（99%）對照品（分析純，美國Sigma公司）；高純水（電阻≥18.0 MΩ，天津納科水處理有限公司）； 0.22 mm濾膜（上海市新亞凈化器件廠）。

1.3 標(biāo)本采集和入選標(biāo)準(zhǔn)

共162例晨尿樣品，其中男性95例，女性67例，年齡25～87歲，中位年齡59歲，平均年齡（62±17.5）歲。82例胃癌患者的尿液取自復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院消化內(nèi)科于2016年2月至2017年5月收治的住院病人，80例正常對照尿液取自健康成年人。胃癌分期參照國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）倡導(dǎo)的TNM分期法：Ⅰ期和Ⅱ期為早期胃癌組，Ⅲ期和Ⅳ期為進展期胃癌組。胃癌患者分期均通過胃鏡和黏膜活檢病理診斷證實。所有入選者同時排除手術(shù)、化療、腎臟疾病及內(nèi)分泌代謝類疾病。每例留取晨尿5 ml，分裝EP管后置于-40 ℃保存。

1.4 標(biāo)本分組

A組為Ⅰ～Ⅱ期胃癌（n=27）；B組為Ⅲ～Ⅳ期胃癌（n=55）；C組為健康成年人（n=80）。

1.5 樣本處理與保存

將尿液樣品從-40 ℃冰箱取出后在4 ℃下解凍，離心5 min（4 000 r/min，4 ℃），取上清液直接注入裝有濾膜的分離管中。待測樣本需冷藏保存，超過2 d的樣本需-40 ℃保存。

1.6 樣本檢測

色譜分析采用AminoPac PA10 分離柱（2 mm×250 mm）與AminoPac PA10保護柱（2 mm×50 mm），流速0.25 ml/min，柱溫度30 ℃，進樣體積25 ml。分析樣品前用H2O-0.25 mol/L NaOH=4∶1（V/V）的淋洗液作流動相，以0.25 ml/min的流速平衡色譜體系30 min。

依照22種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸圖譜的各氨基酸出峰時間和峰型，對制備尿樣色譜圖中色譜峰進行氨基酸（AA）定性分析；并結(jié)合儀器自帶的Peaknet 6 色譜工作站軟件，計算出每個物質(zhì)的相對峰面積（relative peak area），作為定量結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

對色譜峰峰面積進行歸一化處理后進行主成分分析（principal component analysis，PCA），構(gòu)建不同分期胃癌組及正常對照組尿液中AA代謝譜，直觀地觀察代謝產(chǎn)物信息。所有數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進行處理分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組比較采用單因素方差分析；方差不齊時采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在AA的定量分析中，本實驗采用的是每個AA峰面積與TAA的峰面積之比，即用相對峰面積作為原始變量進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，原因是相對峰面積比實際濃度能更好的反映出每個尿樣FAA之間的相互比例關(guān)系。對3組的22種AA色譜峰依照標(biāo)準(zhǔn)分析圖譜進行定性分析后，運用Peaknet 6色譜工作站軟件計算每個AA相對于總氨基酸（TAA）的相對峰面積，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 實際尿液樣本氨基酸代謝譜分析

離子流（IC）分析正常組與胃癌組尿樣色譜峰總離子流（total ion current，TIC）情況，結(jié)果顯示非胃癌組與胃癌組尿樣色譜峰總離子流有差異，在同一保留時間，可見色譜峰的大小、高低不同（圖1）。

2.2 組間比較

與正常組相比，早期胃癌組和進展期胃癌組的纈氨酸（Val），異亮氨酸（Ile）和亮氨酸（Leu）水平升高（P<0.05）， 組氨酸（His）水平降低（P<0.05）， 甲硫氨酸（Met），天冬氨酸（Asp）水平明顯下降（P<0.01，表1）；不同分期胃癌組的氨基酸代謝譜也存在差異，進展期胃癌組異亮氨酸和纈氨酸水平較早期胃癌組下降（P<0.05，表2）。

3 討論

通過對胃癌組和正常組的尿液樣本的離子色譜圖TIC做組內(nèi)比較觀察，發(fā)現(xiàn)存在個體差異性，主要表現(xiàn)在波峰的高度和寬度不盡相同，提示我們尿液的相同代謝成分的濃度不同。作組間比較，可以發(fā)現(xiàn)組間差異大于組內(nèi)差異。特別是胃癌組與正常組之間差異較大。由于IC技術(shù)的局限性，在離子定性分析時必須參照標(biāo)準(zhǔn)圖譜，加上尿液的成分復(fù)雜，各種信號容易產(chǎn)生重疊和交叉，無疑為譜圖的準(zhǔn)確分析帶來了巨大的困難，因而本次實驗重點在于對標(biāo)準(zhǔn)圖譜上已知的22種氨基酸進行各組的歸納分析。

在AA的定量分析中，本實驗采用的是每個AA峰面積與總氨基酸（TAA）的峰面積之比，即用相對峰面積作為原始變量進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，原因是相對峰面積比實際濃度能更好地反映出每個尿樣中游離氨基酸（FAA）之間的相互比例關(guān)系。胃癌患者尿液中氨基酸代謝譜較正常人有明顯變化，說明異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、組氨酸和天冬氨酸等可能是參與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞增殖和基因表達的重要代謝產(chǎn)物；異亮氨酸和纈氨酸水平在早期胃癌組較晚期組上升，提示二者在早期胃癌中可能是重要的代謝產(chǎn)物。盡管我們對以尿液游離氨基酸的代謝譜為基礎(chǔ)的胃癌診斷模型的建立進行了初步的研究，但該模型還有待更多的大規(guī)模樣本檢測來進一步驗證和探討。

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