棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu1的克隆及原核表達(dá)

刁桂萍，楊 帥，遇文婧

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040； 2.黑龍江省林科院森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040)

植物致病真菌的細(xì)胞壁主要由幾丁質(zhì)、β-1,3-葡聚糖、α-1,3-葡聚糖和α-1,4-葡聚糖組成[1-3]。葡聚糖酶具有分解植物病原真菌細(xì)胞壁的能力，因此能夠起到抑制植物真菌的作用[4-6]。Cuddihy等[7]從番茄(Lycopersiconesculentum)的代謝產(chǎn)物中分離純化到一種葡聚糖酶，體外抑菌試驗(yàn)表明，其能抑制番茄病原真菌茄鏈格孢菌(Altemariasolani)的菌絲生長。而在豌豆(Pisumsativum)種子中發(fā)現(xiàn)分子量為26 kDa的葡聚糖酶，能抑制菜豆炭疽菌(Colletotrichumlindemuthianum)和香蕉炭疽菌(Gloeosporiummusarum)菌絲的生長[8]。此外，大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)能誘導(dǎo)大豆葡聚糖酶活性的增強(qiáng)已被證實(shí)，而且大豆(Glycinemax)對大豆疫霉根腐病(P.sojae)的抗性與葡聚糖酶的活性呈正相關(guān)關(guān)系[9]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株棘孢木霉(T.asperellum)ACCC30536，由中國農(nóng)業(yè)微生物保藏管理中心(ACCC)提供。

1.2 葡聚糖酶基因Glu1的克隆及序列分析

利用Trizol法提取棘孢木霉ACCC30536的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)引物g1：5′-ATGACGATCCGCATCCTCGTC-3′和g2：3′-GGTGGAGGATGTTTCTATATC-5′進(jìn)行cDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10中，經(jīng)過PCR檢測后進(jìn)行測序[15]。對獲得的cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析：NCBI Conserved Domains search(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行保守區(qū)和蛋白家族預(yù)測，并尋找相似序列；MEGA5.1軟件進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化樹的建立；ExPASy ProtParam(http:∥www.expasy.org/)分析分子量、等電點(diǎn)和疏水性；SignalP 4.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽；ProtComp 9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；Swissmodel(https:∥www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白的三維結(jié)構(gòu)，模式選自動建模[16-17]。

1.3 葡聚糖酶基因Glu1在不同培養(yǎng)條件下表達(dá)分析

將棘孢木霉ACCC30536菌絲體分別培養(yǎng)在MM[0.5%葡萄糖，15 g·L-1NaH2PO4，5 g·L-1(NH4)2SO4，600 mg·L-1CaCl22H2O，600 mg·L-1MgSO47H2O，5 mg·L-1FeSO4，2 mg·L-1CoCl2，1.6 mg·L-1MnSO4，1.4 mg·L-1ZnSO4]、C饑餓(MM-葡萄糖)，N饑餓(MM-(NH4)2SO4)，羧甲基纖維素鈉(M-葡萄糖+羧甲基纖維素鈉)，山新楊(Populusdavidiana×P.albavar.pyramidlis)根粉(MM+1%山新楊根磨粉)，山新楊莖粉(MM+1%山新楊莖磨粉)，山新楊葉粉(MM+1%山新楊葉磨粉)，病原菌細(xì)胞壁(MM+1%楊樹爛皮病細(xì)胞壁)和病原菌發(fā)酵液(MM+5%楊樹爛皮病發(fā)酵液)[17]共9種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別在誘導(dǎo)0、12、24、48和72 h收取菌絲，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR，每組重復(fù)3次。qRT-PCR反應(yīng)體系：10 μL的2×SYBR Green Real-time PCR Master mix，0.5 μL引物，2 μL的cDNA，ddH2O定量至總體積20 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，59 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s；82 ℃，讀板1 s；45個循環(huán)；55～95 ℃，每間隔0.5 ℃讀板1 s。并采用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因表達(dá)量[17]。Glu1基因及內(nèi)參基因(Actin，α-tubulin和β-tubulin)引物如表1所列。

1.4 葡聚糖酶基因Glu1原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)Glu1基因序列和原核表達(dá)載體序列設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，G1e:5′-ATCGGGATCCATGACGATCCGCATCCTCGTC-3′(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn))G2e:5′-CGATGCGGCCGCGGTGGAG-GATGTTTCTATATC-3′(下劃線為NotI酶切位點(diǎn))。以棘孢木霉ACCC30536的cDNA為模板，G1e和G2e為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用BamHI和NotI限制性內(nèi)切酶對PCR的回收產(chǎn)物及pGEX-4T-2質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10感受態(tài)中，在含終濃度為50 mg·L-1羧芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基中篩選，并對獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和雙酶切檢測[18]。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers

1.5 葡聚糖酶基因Glu1的原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中。將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子接種于3 mL含50 mg·L-1羧芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)12 h。次日用新鮮培養(yǎng)基稀釋過夜的菌液，待菌液OD600為0.4～0.6時，加入終濃度為1.0 mmol·L-1IPTG，于30 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)6 h，進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，以IPTG誘導(dǎo)的含pGEX-4T-2空載的大腸肝菌BL21及未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21作為對照，并通過電轉(zhuǎn)化進(jìn)行蛋白純化[15]。

1.6 重組葡聚糖酶的酶活特性分析

采用還原糖測定法[19]，測定不同pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0)及不同反應(yīng)溫度(30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃)對重組葡聚糖酶酶活的影響。然后在最適溫度和pH條件下測定不同誘導(dǎo)時間(1、2、3、4、5和6 h)對重組葡聚糖酶活性的影響。以沸水浴中失活的粗酶液作對照，每組重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu1的克隆與序列分析

棘孢木霉Glu1基因的cDNA序列全長為984 bp，編碼327個氨基酸(圖1)。ProtParam軟件分析表明，該葡聚糖酶的分子由4 956個原子構(gòu)成，分子式為C1592H2456N406Q494S8，相對分子量為35 443.92，等電點(diǎn)為4.76，含有20種氨基酸(表2)。通過BlastP預(yù)測該蛋白屬于Glyco-hydro-12家族(圖2A)。葡聚糖酶Glu1具有多個磷酸化位點(diǎn)，其中有18個蘇氨酸磷酸化作用位點(diǎn)(Thr：18)、13個絲氨酸磷酸化作用位點(diǎn)(Ser：13)和5個酪氨酸磷酸化作用位點(diǎn)(Tyr：5)，說明該葡聚糖酶磷酸化以蘇氨酸和絲氨酸磷酸化為主，兼有酪氨酸磷酸化(圖2B)。在葡聚糖酶Glu1第22和23個氨基酸中間有一個信號肽酶剪切位點(diǎn)LGI∥LF存在，第35和36個氨基酸中間有一個信號肽酶剪切位點(diǎn)TGO∥PP存在(圖2C)。棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶的三級結(jié)構(gòu)與模板β-1,4-葡聚糖酶(4h7m.1)的結(jié)構(gòu)有36%的相似性(大于30%可以期望得到較好的預(yù)測結(jié)果)，由此推測，棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶屬于β-1,4-葡聚糖酶(圖2D)。

2.2 棘孢木霉葡聚糖酶Glu1多序列比對及進(jìn)化樹分析

通過Blastp獲得Glu1相似的氨基酸序列，從中選取相似性較高的13個序列進(jìn)行分析(圖3)，其中深綠木霉IMI 206040(XP_013940397.1，相似度91%)、貴州木霉(OPB37643.1，相似度82%)、綠色木霉Gv29-8(XP_013954335.1，相似度81%)和里氏木霉QM6a(XP_006964596.1，相似度79%)的Glyco-hydro-12家族葡聚糖酶相似度最高。將Glu1和13個相似序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析(圖4)，結(jié)果表明Glu1和13個相似序列被分成5組，其中Glu1和所有木霉屬的Glyco-hydro-12家族葡聚糖酶分成一組(Group 1)，其中Glu1和深綠木霉IMI 206040(XP_013940397.1)的Glyco-hydro-12家族葡聚糖酶同源性最高，親緣關(guān)系最近，而其他屬的Glyco-hydro-12家族葡聚糖酶被分為4組(Group 2、Group 3、Group 4和Group 5)。

表2 Glu1基因的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of Glu1

1ATGACGATCCGCATCCTCGTCAACGCTGCGCTGCTGGCCATCCCCATCGCCGTGACGCTGMTIRILVNAALLAIPIAVTL61GGCATCTTGTTCGGCCTCCAATCGCACCGAGATGCCACGGGCCAGCCGCCTTTGTTTGCGGILFGLQSHRDATGQPPLFA121CCTCAACCGCCGCCGATTCCAACTCCTGCACCGCCGAAACCCCCAAAGAATGGCGTCACCPQPPPIPTPAPPKPPKNGVT181AAGACGAGATATTGCCAAAAGTCGTATGGAATTACACCAGATACCACTGGGCAGCAGTATKTRYCQKSYGITPDTTGQQY241ATATTAAATCCTAATCAATGGAACTGGAACGTCGGCGATCCTGGACGCCTGTGTATGAATILNPNQWNWNVGDPGRLCMN301GTCACCACGTTTAACAACGGCACATATGCCACAAGCACTACCGCTCCTCAGTTTATGGTTVTTFNNGTYATSTTAPQFMV361TCATGGCAATATCCCCGTGGCCCAGAGGACAACCCTGTACACGCTTTCCCCAACATCCAGSWQYPRGPEDNPVHAFPNIQ421ATTGATACCGACGTCATTCCCGCCACTGTGAACAGCATTTCCAAAGTCGACATCGACATCIDTDVIPATVNSISKVDIDI481GAATGGTCCTACGGCGTCGGCAATGAGACCACAACGTCTTCTACCCTCGCGGATCTTACTEWSYGVGNETTTSSTLADLT541GCCGACAATCTCAACACCAACGTTGCTGTCGATATGTTTATTGACAGCGATAAGACGGCCADNLNTNVAVDMFIDSDKTA601GCTCAGAACCCTGCCAAGGCCAAGTTCGAACTCATGGTTTGGTTTGCGGCCTATGGTAGTAQNPAKAKFELMVWFAAYGS661TCCACTCAGCCCATCGGTTTTAGCAACGGTGCTGTGTCCACCCAAACGCTTAATGGCAACSTQPIGFSNGAVSTQTLNGN721ACATTCAATCTTTATGCTGGCATTAACACAGCGACCAAGCAAAACGTCATGACCTGGTACTFNLYAGINTATKQNVMTWY781ACCGACACGCCTATACAAAAGTTCAATGGAGACATATCTCCACTCATCAACAGCGTGTTCTDTPIQKFNGDISPLINSVF841AAGCTCACCACTGTTACCGATATTCCCAAGTCTAGCGACTACTTGGGATACCTGGCTCTGKLTTVTDIPKSSDYLGYLAL901GGCTCCGAGGCCTTTTCCGTTGACAAGACCGTCACGCTTTACGTACCCCAACTCTCGATAGSEAFSVDKTVTLYVPQLSI961GATATAGAAACATCCTCCACCTAG*DIETSST

圖1Glu1基因的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig.1cDNAsequenceoftheGlu1geneandpredictedaminoacidsequenceoftheGlu1protein

粗體表示cDNA序列；斜體表示cDNA編碼的氨基酸序列。

Bold text indicates the cDNA sequence; italic text indicates the amino acid sequence encoded by the cDNA.

圖2 葡聚糖酶Glu1的保守區(qū)、磷酸化位點(diǎn)、信號肽及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig. 2 Image of the conserved region, phosphorylation site, signal peptide site, and tertiary structure of the predicted Glu1 sequence

A：Glu1的保守區(qū)；B：Glu1的磷酸化位點(diǎn)；C：Glu1的信號肽；D：Glu1的三級結(jié)構(gòu)。

A: conserved region of Glu1; B: phosphorylation site of Glu1; C: signal peptide site of Glu1; D: tertiary structure of Glu1.

2.3 棘孢木霉葡聚糖酶基因Glu1在9種誘導(dǎo)條件下的表達(dá)分析

運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測9種誘導(dǎo)條件下棘孢木霉Glu1基因的調(diào)控表達(dá)水平(圖5)。在MM(圖5A)、N饑餓(圖5C)、1%山新楊根粉(圖5E)、1%山新楊莖粉(圖5F)、1%山新楊葉粉(圖5G)、1%楊樹爛皮病菌細(xì)胞壁(圖5H)和5%楊樹爛皮病菌發(fā)酵液(圖5I)培養(yǎng)條件下，Glu1基因均呈上調(diào)表達(dá)，分別在12、24、24、12、12、24和48 h達(dá)到峰值，分別為未誘導(dǎo)時的12.13(23.6)、13.93(23.8)、45.25(25.5)、10.56(23.4)、8.57(23.1)、6.06(22.6)和8.57(23.1)倍。但是，在C饑餓(圖5B)和羧甲基纖維素鈉(圖5D)培養(yǎng)條件下，Glu1基因呈下調(diào)表達(dá)，分別在24和12 h下調(diào)至最低點(diǎn)，分別低于未誘導(dǎo)時的6.96(22.8)和21.11(24.4)倍。說明Glu1基因在棘孢木霉響應(yīng)環(huán)境壓力中起到重要作用，并且能夠參與棘孢木霉對楊樹(Populus)或楊樹病原菌的識別。

2.4 棘孢木霉葡聚糖酶Glu1的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE檢測結(jié)果(圖6)顯示，重組轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，泳道1-5清晰可見蛋白條帶，大小與61.44 kDa的預(yù)測蛋白一致，而對照泳道6在相應(yīng)位置沒有條帶出現(xiàn)，證明Glu1基因成功整合到大腸桿菌BL21中；而且誘導(dǎo)6 h的重組蛋白明顯多于誘導(dǎo)2和4 h的重組蛋白，說明IPTG誘導(dǎo)時間越長，轉(zhuǎn)化子分泌的蛋白越多。對變性復(fù)性后的蛋白進(jìn)行電純化后，獲得純化后的目的蛋白rGlu1。

圖3 葡聚糖酶Glu1及其相似序列的多序列比對Fig. 3 Multiple sequence alignment of Glu1 and the similar sequences

*表示同源identity；XP_013940397.1: 深綠木霉T.atrovirideIMI 206040; OPB37643.1：貴州木霉T.guizhouense; XP_013954335.1：綠色木霉T.virensGv29-8; XP_006964596.1：里氏木霉T.reeseiQM6a; XP_006964596.1：里氏木霉T.reeseiQM6a; EQL01618.1：冬蟲夏草OphiocordycepssinensisCO18; KIM99495.1：大孢樹粉孢菌OidiodendronmaiusZn; KJK64291.1：寄生曲霉AspergillusparasiticusSU-1; XP_007817188.1：羅伯茨綠僵菌MetarhiziumrobertsiiARSEF 23; XP_014543006.1：羅伯茨綠僵菌MetarhiziumbrunneumARSEF; XP_014572972.1：大孢綠僵菌MetarhiziummajusARSEF 297; KDB11778.1：稻曲病菌Ustilaginoideavirens; KXG45790.1：灰黃霉Penicilliumgriseofulvum。

2.5 重組葡聚糖酶rGlu1酶活特性

首先測定不同濃度葡萄糖的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程y=0.000 8x-0.003 9，R2=0.973 2。根據(jù)回歸方程，分析在不同pH、不同反應(yīng)溫度和不同反應(yīng)時間下rGlu1的酶活特性。在不同pH條件下，rGlu1活性呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)pH為4.5時，rGlu1活性最大，為1.81 U·mL-1(圖7A)；在不同反應(yīng)溫度條件下，rGlu1活性也呈先增加后降低的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時，rGlu1活性最大，為1.86 U·mL-1(圖7B)；在不同反應(yīng)時間條件下，rGlu1活性呈遞增的趨勢，在5 h達(dá)到峰值，為1.80 U·mL-1，之后趨于平緩(圖7C)。這些結(jié)果表明，重組葡聚糖酶最適pH為4.5，偏酸性，最適溫度為45 ℃，且隨著時間的增加，重組酶活性逐漸增加，并于5 h后趨于平穩(wěn)。

圖4 葡聚糖酶Glu1及其相似序列的進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of Glu1 and the similar sequences

所有分支顯示了可靠的置信度(超過50%的引導(dǎo)值)；線段上的數(shù)字表示堿基替換率。

All branches show significant support (>50% bootstrap values); the numbers on the line segments indicate the base replacement rates.

圖5 9種誘導(dǎo)條件下Glu1基因差異表達(dá)Fig. 5 Expression level of the gene Glu1 under nine different induction conditions

圖6 重組蛋白的SDS-PAGE檢測Fig. 6 SDS-PAGE detection of recombinant protein

M：Protein marker；1-5：IPTG分別誘導(dǎo)2、3、4、5和6 h，重組轉(zhuǎn)化子BL21-Glu1蛋白SDS-PAGE電泳圖；6：IPTG誘導(dǎo)6 h，對照轉(zhuǎn)化子BL21-BL21-pGEXSDS-PAGE電泳圖；7：純化后的重組蛋白rGlu1 SDS-PAGE電泳圖。

M: Protein Marker; 1-5: SDS-PAGE analysis of the transformant BL21-Glu1 induced for 2, 3, 4, 5, and 6 h, respectively; 6: SDS-PAGE analysis of the control transformant BL21-pGEX induced for 6 h; 7: SDS-PAGE analysis of purified recombinant rGlu1.

圖7 重組葡聚糖酶rGlu1酶活特性Fig. 7 Enzyme activity properties of recombinant rGlu1

3 討論與結(jié)論

木霉菌種類繁多，其分泌的代謝產(chǎn)物也相當(dāng)豐富，其中抗真菌次生代謝物和細(xì)胞壁水解酶協(xié)同作用可導(dǎo)致植物病原真菌死亡[20]。細(xì)胞壁水解酶中的葡聚糖能夠水解植物病原真菌細(xì)胞壁最外層覆蓋的葡聚糖層，使細(xì)胞壁骨架和細(xì)胞受損,而且抑菌試驗(yàn)也表明葡聚糖酶對多種真菌菌絲的生長有抑制作用[21]。本研究從棘孢木霉ACCCC30536菌株基因組中克隆到一個葡聚糖酶基因Glu1，cDNA序列全長984 bp，由327個氨基酸組成，通過生物信息學(xué)分析推測此酶屬于β-1,4-葡聚糖酶。一些研究表明，β-1,4-葡聚糖酶在纖維素的水解過程中起著非常關(guān)鍵的作用，它能夠作用于纖維素鏈內(nèi)的β-1,4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子水解成更小分子量的葡萄糖聚合物[20,22]。插入β-1,4-葡聚糖酶的綠色木霉對小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)的抑制效果較原始木霉菌株明顯提高，抑制率提高了27%[21]。因此，本研究中的Glu1蛋白可能具有與β-1,4-葡聚糖酶一樣的生防特性。

在正常環(huán)境下葡聚糖酶在生物體中的含量較少，活性很低。當(dāng)生物體受到外界刺激時，葡聚糖酶可以被刺激物所誘導(dǎo)和積累[9]。研究表明，霍爾斯單軸霉(Plasmoparahalstedii)侵染后的向日葵(Helianthusannuus)，其葡聚糖酶基因表達(dá)量明顯升高[23]。在本研究中，當(dāng)棘孢木霉ACCC30536與山新楊及楊樹病原菌互作后，Glu1基因的表達(dá)也明顯上升，表明Glu1蛋白參與了生防菌棘孢木霉與楊樹及楊樹病原菌的識別，從而使楊樹(Populus)可能通過調(diào)節(jié)自身防御基因表達(dá)和生理變化來適應(yīng)環(huán)境或抵御病原真菌。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了Glu1基因的原核表達(dá)載體并獲得重組葡聚糖酶rGlu1。酶活特性分析表明，該重組rGlu1活性的最適pH為4.5，偏酸性，最適溫度為45 °C，與玉蜀黍赤霉菌(Gibberellazeae)的β-1,4-葡聚糖酶重組蛋白酶酶活特性報道結(jié)果一致[23]。此外，重組酶酶活受時間影響較大，隨著時間的增加，酶活也逐漸增加，并于5 h后趨于平穩(wěn)。 以上這些研究結(jié)果將為進(jìn)一步探究葡聚糖酶的生防功能提供理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用葡聚糖酶類生物農(nóng)藥奠定良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。