沉默結(jié)締組織生長因子對(duì)酒精性肝纖維化干預(yù)效果的研究

崔小偉 劉曉智

1天津市濱海新區(qū)大港醫(yī)院消化內(nèi)科（天津 300270）；2天津市第五中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（天津 300450）

過度飲酒已成為世界范圍內(nèi)引起肝臟損害的主要原因，而慢性長期酒精濫用會(huì)引起肝臟的炎癥、纖維化，甚至進(jìn)而發(fā)展為肝硬化，酒精性肝硬化發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害了人們的身體健康，給家庭和國家?guī)砹顺林刎?fù)擔(dān)［1-2］，在美國和歐洲，酒精性肝硬化是肝移植的第二大適應(yīng)證［3］，酒精性肝硬化發(fā)生腹水及發(fā)展成肝癌的風(fēng)險(xiǎn)均高于丙肝肝硬化，雖然已經(jīng)證明戒酒及大量糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用可以改善酒精性肝纖維化患者的存活率，但仍有40%的嚴(yán)重患者治療后無效［4］。迄今為止尚沒有能夠逆轉(zhuǎn)或抑制酒精性肝硬化病情惡化的有效藥物，因此抑制酒精性肝纖維化的進(jìn)展成為了人們十分重視卻無法解決的難題。本研究以酒精性肝纖維化發(fā)病機(jī)制中較具研究價(jià)值的分子靶點(diǎn)——結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）作為藥物作用對(duì)象，選擇當(dāng)前具有良好應(yīng)用前景且相對(duì)成熟的RNAi（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)為治療手段，利用體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ剑瑢?duì)CTGF被抑制后對(duì)酒精性肝纖維化的進(jìn)展進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性研究。

1 材料與方法

1.1 試劑和動(dòng)物 鼠肝星形細(xì)胞HSC?T6購自上海腫瘤研究所，胎牛血清（杭州四季青），改良Eagle培養(yǎng)基（dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）、青鏈霉素和胰蛋白酶（Gibco公司），Lipo?fectamine 2000（美國Invitrogene公司）；靶向CTGF的siRNA由武漢晶賽生物技術(shù)有限公司合成；CTGF、Ⅰ和Ⅲ型膠原抗體（美國Chemicon公司）。雄性SD大鼠40只，購自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)血液病研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)條件為無菌，溫度20～25℃，濕度（50±5）%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染 肝星形細(xì)胞HSC?T6培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，且飽和濕度。隔天換液，每3～4天傳代1次。實(shí)驗(yàn)分組：（1）脂質(zhì)體組：僅加入Lipo?fectamineTM2000脂質(zhì)體；（2）無義序列組：加入NS?siR?CTGF/Lipofectamine?2000 脂質(zhì)體復(fù)合物；（3）siR?CTGF組：加入siR?CTGF/Lipofectamine?2000 脂質(zhì)體復(fù)合物。細(xì)胞生長至約70%～85%融合時(shí)，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，G418篩選，獲得穩(wěn)定基因轉(zhuǎn)染的肝星形細(xì)胞HSC?T6。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn) 于96孔板中按1×104個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行細(xì)胞接種，于培養(yǎng)第1、2、3、4、5、6天行MTT實(shí)驗(yàn)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔波長570 nm的光吸收值，記錄結(jié)果并繪制細(xì)胞生長曲線；實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置空白對(duì)照組，3個(gè)平行孔。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 消化收集上述3組細(xì)胞，PBS重懸，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。按照AnnexinV/PI染色試劑盒說明加入固定破膜劑和PI染液，室溫避光反應(yīng)30 min，熒光顯微鏡下隨機(jī)檢測(cè)10個(gè)高倍視野，比較各組凋亡細(xì)胞的比例。

1.5 Western blot方法 提取細(xì)胞總蛋白，Brad?ford法蛋白定量后，使用8%分離膠電泳，冰浴下 100 V轉(zhuǎn)膜60 min。CTGF（1∶1 000）、Ⅰ型膠原（1∶1 000）和Ⅲ型膠原（1∶2 000），4℃水平搖床孵育過夜，次日使用辣根酶標(biāo)記的1∶500稀釋二抗孵育1 h。凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，Quantity One軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 動(dòng)物模型的建立 以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用蒸餾水配制含40%酒精的白酒，按10 mL/kg每日分2次灌胃造模4周，第5周酒精濃度升至50%，繼續(xù)每日分2次灌胃8周。8周末，隨機(jī)選取3只大鼠處死觀察肝臟組織病理學(xué)變化以確定造模成功，病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照王泰齡法［5］。選36只大鼠模型隨機(jī)分為3組，每組12只。（1）脂質(zhì)體組，采用門靜脈灌注方法注射Lipofectamine?2000脂質(zhì)體，每次注射1 mL，每3天重復(fù)注射一次。（2）無義序列組，以 20 μg/mL 的濃度注射NS?siR?CTGF/Lipo?fectamine?2000脂質(zhì)體復(fù)合物，每次注射 1 mL，每3天重復(fù)注射一次。（3）siR?CTGF組：以siR?CTGF/Lipofectamine?2000脂質(zhì)體復(fù)合物代替NS?siR?CTGF/Lipofectamine?2000脂質(zhì)體復(fù)合物，其他步驟同前。各組于造模起第12周末處死大鼠，采集血清及肝組織標(biāo)本待測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.7 血清ALT、AST與TBIL含量檢測(cè) 應(yīng)用半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST與TBIL含量。

1.8 肝組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)與免疫組織化學(xué)分析 常規(guī)石蠟包埋，切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肝組織病理改變，病理學(xué)醫(yī)師對(duì)觀察結(jié)果進(jìn)行肝纖維化病理學(xué)分級(jí)。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CTGF的表達(dá)，CTGF抗體稀釋濃度為1∶1 000，DAB法顯色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果 接受單純脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的肝星形細(xì)胞 HSC?T6 和接受NS?siR?CTGF/Lipofectamine?2000脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長速度相似，但接受siR?CTGF/Lipofectamine?2000脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染的HSC?T6細(xì)胞增殖速度較前兩者明顯變慢，各時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長曲線比較Fig.1 Comparison of growth curve of cells from different groups

2.2 細(xì)胞凋亡結(jié)果 見圖2，紅色信號(hào)示處于凋亡早期的陽性細(xì)胞核，通過10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)比較發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體組細(xì)胞凋亡率為（1.73±0.39）%，無義序列組細(xì)胞凋亡率為（1.98±0.42）%，二組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.17，P＞ 0.05）；siR?CT?GF組細(xì)胞凋亡率為（21.32±6.45）%，與前兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=119.49，P＜0.01）。

2.3 Western blot結(jié)果 脂質(zhì)體組和無義序列組間CTGF、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），在siR?CTGF組上述三個(gè)檢測(cè)指標(biāo)均明顯低于脂質(zhì)體組和無義序列組，其中CTGF和Ⅲ型膠原與前兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），Ⅰ型膠原與前兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡情況比較（紅色：陽性凋亡信號(hào)，藍(lán)色：PI標(biāo)記的細(xì)胞核，×200）Fig.2 Comparison of apoptosis from different groups（Red：positive apoptotic signals，Blue：nucleus labeled PI，× 200）

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組中特定蛋白的檢測(cè)（A，Western blot結(jié)果；B，柱形圖）Fig.3 Detection of specific proteins in different groups（A，Western blot results；B，Histogram）

2.4 肝功能比較 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示脂質(zhì)體組和無義序列組間三個(gè)檢測(cè)指標(biāo)ALT、AST和TBIL比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但siR?CTGF組各檢測(cè)指標(biāo)均明顯低于前兩組，提示肝功能有明顯恢復(fù)，見表1。

2.5 造模結(jié)果

2.5.1 大鼠一般情況 大鼠精神萎靡，皮毛干燥、粗糙、無光澤，飲食量減少，體質(zhì)量下降，大便不成形或干燥。

表1 各組間肝功能指標(biāo)檢測(cè)Tab.1 Liver function tests of different groups ±s

表1 各組間肝功能指標(biāo)檢測(cè)Tab.1 Liver function tests of different groups ±s

注：與脂質(zhì)體組比較，*P＜0.05；與無義序列組比較，ΔP＜0.05

組別脂質(zhì)體組無義序列組siR?CTGF組F值P值例數(shù)10 10 10 ALT（U/L）178.65±13.54 188.61±17.59 98.21 ± 9.33*Δ 89.31 0.005 AST（U/L）213.34±25.64 204.37±29.81 104.59 ± 14.55*Δ 91.25 0.004 TBIL（μmol/L）71.45±9.98 74.48±8.45 45.31±6.77*78.660.024

2.5.2 肝臟形態(tài)及病理學(xué)改變 造模大鼠肝臟表面凹凸不平，色澤晦暗，邊緣變鈍，鏡下肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見點(diǎn)灶狀壞死，少數(shù)區(qū)域肝界板壞死，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤，膠原纖維沿匯管區(qū)及中央靜脈周圍向肝小葉內(nèi)延伸，纖維間隔形成，為肝纖維化表現(xiàn)。

2.6 不同實(shí)驗(yàn)組組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果 見圖4，可見在HE染色切片中，脂質(zhì)體組和無義序列組中有大量直徑較寬粗的纖維組織增生，較多的纖維間隔形成，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但在siR?CTGF組中纖維組織及膠原減少、變細(xì)，纖維間隔變少，小葉結(jié)構(gòu)變清晰，炎細(xì)胞浸潤減輕，小葉間膽管增生減輕。在脂質(zhì)體組和無義序列組免疫組化切片中可見CTGF表達(dá)增多，且主要表達(dá)于纖維組織增生部位，而在siR?CTGF組中CTGF的表達(dá)量要低于前兩者。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物模型肝組織切片形態(tài)學(xué)與病理特征比較Fig.4 Comparison of morphological and pathological features of liver tissue slices of animal models from different groups

3 討論

目前肝硬化作為一種全球性的疾病，居人類主要死因的第6位，而酒精性肝硬化的發(fā)病率逐漸升高，且呈年輕化的趨勢(shì)［6］，雖酒精性肝硬化的機(jī)制不明確，且不可逆，但其發(fā)展的必經(jīng)階段肝纖維化卻是一個(gè)逐漸進(jìn)展、且可逆的過程［7］。研究表明，肝纖維化發(fā)生過程的核心是肝臟星狀細(xì)胞（hapatic stellate cells，HSC）的活化，活化的HSC有促進(jìn)增殖、纖維形成、致炎和收縮作用，合成大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），沉積于肝內(nèi)，導(dǎo)致肝纖維化。因此抑制HSC活化，被認(rèn)為是肝纖維化治療的重要策略［2，8］。無論實(shí)驗(yàn)性還是臨床肝纖維化都發(fā)現(xiàn)CTGF的高表達(dá)，且主要是在HSC中的表達(dá)上調(diào)［9］，說明HSC是CTGF的主要來源，在HSC激活過程中CTGF表達(dá)增加。CT?GF可促進(jìn)HSC活化、增殖，促進(jìn)其移行，阻斷CT?GF的表達(dá)可以抑制HSC?T6細(xì)胞的增殖，CTGF的持續(xù)過度表達(dá)可以上調(diào)Ⅰ型膠原蛋白質(zhì)的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，CTGF還可以作為一個(gè)獨(dú)立的因素引起多個(gè)臟器的纖維化，因此在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［10-12］。RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默的強(qiáng)大工具，化學(xué)合成siRNA能在哺乳動(dòng)物體內(nèi)外介導(dǎo)同源基因沉默，從而具有治療作用［13］。本研究以在酒精性肝纖維化領(lǐng)域涉及較少的CTGF為研究靶點(diǎn)，通過較成熟的RNAi技術(shù)，成功轉(zhuǎn)染鼠肝星形細(xì)胞HSC?T6，并通過MTT法、細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，表明siRNA技術(shù)可以成功下調(diào)CTGF的表達(dá)并進(jìn)一步抑制HSC的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過western blot方法的檢測(cè)表明CTGF的表達(dá)下降可以減少在肝纖維化過程中起重要作用的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，進(jìn)而可以延緩肝纖維化的進(jìn)展。

目前常用的酒精性肝病動(dòng)物模型有急性酒精灌胃模型、慢性酒精喂養(yǎng)模型（Lieber?DeCarli模型）、胃內(nèi)喂養(yǎng)模型（Tsukamoto?French模型）、“二次打擊”或“多次打擊”模型、慢性酒精喂養(yǎng)加急性酒精灌胃模型（Gao?binge模型）等方法［14-15］，由于技術(shù)、經(jīng)濟(jì)等原因，國內(nèi)研究者多采用急性酒精灌胃模型。本研究體內(nèi)研究部分采用酒精灌胃模型建立酒精性肝纖維化的動(dòng)物模型，模型大鼠的肝功能明顯受損，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤，膠原纖維增生，纖維間隔形成，經(jīng)治療后，siR?CTGF組的ALT、AST、TBIL明顯降低，提示肝功能恢復(fù)，同時(shí)免疫組化結(jié)果表明siR?CTGF治療組的纖維組織及膠原減少、纖維間隔變少，小葉結(jié)構(gòu)變清晰，小葉間膽管增生減輕，纖維化程度減輕［5］。表明siRNA技術(shù)可能通過抑制CTGF的表達(dá)進(jìn)而抑制肝纖維化的進(jìn)程。

總之，本研究通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明，siRNA干擾技術(shù)可以降低HSC?T6細(xì)胞CTGF的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)下降，改善肝功能及肝纖維化程度，對(duì)于酒精性肝纖維化的發(fā)展可能有一定的抑制作用。CTGF可以成為延緩肝纖維化的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)［16］。但是，本研究也僅是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞的研究，目前并不適用于臨床，而且也只是能延緩鼠肝纖維化的進(jìn)展但并不能完全逆轉(zhuǎn)肝硬化，下一步仍然需要大量的實(shí)驗(yàn)與臨床工作相結(jié)合以進(jìn)一步了解肝硬化的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而找到適用于臨床的有效的治療手段。