小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植途徑對(duì)肝硬化治療效果的比較

王 敏， 胡 皓， 韓 英

1.上海市兒童醫(yī)院，上海 200062；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院

肝硬化是由于不同病因長(zhǎng)期作用而引起肝臟慢性、彌漫性改變[1]。每年因各種原因所致肝硬化死亡人數(shù)高達(dá)50萬[2]。肝硬化作為肝臟病發(fā)展的終末階段，目前臨床上廣泛采用的治療策略是保護(hù)殘存肝細(xì)胞及對(duì)癥治療，但總體療效欠佳[3]。干細(xì)胞因其具有多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)能力，可以通過定向分化成肝細(xì)胞、旁分泌免疫調(diào)節(jié)因子等作用改善肝功能[4]。實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)[5-6]證實(shí)，干細(xì)胞治療可減輕肝硬化程度，改善終末期肝病患者肝功能,因而逐漸成為肝硬化及終末期肝病治療的新選擇。目前報(bào)道的干細(xì)胞移植途徑主要有外周靜脈、肝門靜脈、腹腔等[7]。以往研究主要將干細(xì)胞治療機(jī)制及效果作為評(píng)價(jià)內(nèi)容，而對(duì)于決定干細(xì)胞定植及治療效果非常重要的干細(xì)胞移植途徑的因素[8]卻少有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在小鼠肝硬化模型上，對(duì)比外周靜脈、門靜脈及腹腔三種移植途徑移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療肝硬化的效果，通過定植細(xì)胞數(shù)量、組織學(xué)及肝功能比較，評(píng)價(jià)三種移植方式的優(yōu)劣。為干細(xì)胞治療終末期肝病的最優(yōu)移植途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑、儀器設(shè)備4周齡雄性C57BL/6小鼠、C57BL/6-GFP+轉(zhuǎn)基因小鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證：SCXK(軍)2007-007]。CCl4、天狼星紅購(gòu)自Sigma公司，小鼠MSCs培養(yǎng)基、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基購(gòu)自廣州塞業(yè)生物技術(shù)有限公司，胎牛血清DMEM/F12、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，流式鑒定抗體購(gòu)自Biolegend公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD公司，熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司。

1.2MSCs分離及培養(yǎng)脫頸處死C57BL/6-GFP+小鼠，用質(zhì)量濃度為750 g/L的乙醇浸泡消毒；超凈臺(tái)中取脛腓骨，剝離肌肉和結(jié)締組織，剪斷股骨脛骨兩端，用1 ml注射器沖出骨髓，經(jīng)70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)后于4 ℃離心，離心率棄去上清，加入2 ml紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，D-PBS液混勻終止裂解紅細(xì)胞；離心重懸，加骨髓MSCs完全培養(yǎng)基，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，孵箱中培養(yǎng)。絕對(duì)靜置3 d后首次換液，洗去未貼壁的細(xì)胞；之后隔天換液至第3代行流式細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定及成骨成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。

1.3MSCs流式鑒定及定向分化

1.3.1 流式鑒定：將第3代MSCs消化、重懸為單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，PBS重懸為107ml-1的細(xì)胞懸液。EP管中加入上述制備的懸液100 μl。分別加入流式抗體PE-CD90、FITC-CD29、PE-CD44、PE-CD34、FITC-CD45、PE-CD31，反復(fù)吹打，充分混合，室溫避光孵育、清洗后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 成骨誘導(dǎo)：明膠鋪板，晾干備用；將第3代MSCs消化接種于明膠板，加入適量成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)。每3 d更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，當(dāng)光鏡下可見大量鈣結(jié)節(jié)時(shí)，換為每2 d進(jìn)行1次半量換液；約4周后誘導(dǎo)完成。質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定，茜素紅染液染色觀察。

1.3.3 成脂誘導(dǎo)：將第3代MSCs加入骨髓MSCs成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液，誘導(dǎo)3 d后，加入骨髓MSCs成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液。誘導(dǎo)24 h后，換回A液繼續(xù)誘導(dǎo)；如此交替5次。直至脂滴足夠大和圓。質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定，油紅O染色觀察。

1.3.4 成軟骨誘導(dǎo)：將2.5×105第3代MSCs放入15 ml離心管，加入成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(D-MEM培養(yǎng)基加入地塞米松、抗壞血酸、ITS添加物、丙酮酸鈉、脯氨酸及TGF-β3)，24 h內(nèi)不要晃動(dòng)。24～48 h后即可在離心管管底形成細(xì)胞小球。隔天換液1次，連續(xù)誘導(dǎo)4周。包埋固定切片后甲苯胺藍(lán)染色觀察。

1.4肝硬化模型構(gòu)建選取50只6周齡雄性C57BL/6小鼠行肝硬化造模實(shí)驗(yàn)。采用CCl4誘導(dǎo)法。將CCl4溶于橄欖油中配制成誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑濃度按照第1周為13%、第2周為16%、第3周開始為20%直至造模結(jié)束。每周行2次腹腔注射，造模時(shí)間共計(jì)8周。注射劑量為7 ml/kg。另取同窩小鼠10只為對(duì)照，給予7 ml/kg橄欖油，注射時(shí)間周期與造模組相同。

1.5MSCs移植造模后C57BL/6小鼠隨機(jī)分為4組，分別為未移植組、尾靜脈移植(IV)組、門靜脈移植(PV)組、腹腔移植(IP)組。各組移植MSCs細(xì)胞數(shù)為1×106。周圍靜脈移植組采用尾靜脈注射法，緩慢注射。IP組采用腹腔注射法，于小鼠下腹部腹白線向左5 mm 注射。PV組：麻醉小鼠后在腹中部開口1～2 cm，將腸管右移充分暴露門靜脈，穿刺門靜脈緩慢注射細(xì)胞，拔出針頭后用棉簽輕壓5～10 min以防滲血，將腸管復(fù)位后關(guān)腹縫合。移植后3 d冰凍切片行定植細(xì)胞分析，采用Image Pro Plus 6.0統(tǒng)計(jì)[9]。

1.6組織學(xué)分析及生化檢測(cè)小鼠肝臟組織用質(zhì)量濃度為100 g/L的甲醛固定，石蠟包埋行HE染色及天狼星染色。觀察肝內(nèi)結(jié)構(gòu)及纖維沉積情況。小鼠心臟取血，行全自動(dòng)生化分析。

2 結(jié)果

2.1MSCs的培養(yǎng)及分化鑒定光鏡下MSCs呈長(zhǎng)梭樣生長(zhǎng)，形態(tài)均一，成平行或漩渦狀生長(zhǎng)。取第3代細(xì)胞行細(xì)胞定向分化。成骨誘導(dǎo)分化4周后，茜素紅染色可見細(xì)胞內(nèi)大量鈣結(jié)節(jié)沉積。成脂誘導(dǎo)3周后，油紅O染色可見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)紅色圓形脂滴。成軟骨誘導(dǎo)分化4周后，可見細(xì)胞內(nèi)酸性黏多糖被成甲苯胺藍(lán)染成淡藍(lán)色(見圖1A～1C)。

取3代細(xì)胞行流式分析，細(xì)胞表面分子特征為：MSCs表面分子CD90、CD44、CD29高表達(dá)，而造血干細(xì)胞表面分子CD34、CD45陰性，內(nèi)皮細(xì)胞表面分子CD31陰性。提示MSCs分離效果良好(見圖1D)。

2.2肝硬化大鼠模型構(gòu)建8周后，50只C57BL/6造模小鼠存活43只，死亡7只，存活率86%。存活小鼠毛色無光，體質(zhì)量較對(duì)照組輕[(21.38±3.34)gvs(25.4±3.34)g，P<0.001)]。隨機(jī)取其中3只小鼠處死后行大體及病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，正常小鼠肝臟顏色紅潤(rùn)，表面光滑，邊角銳利，質(zhì)地柔軟，無細(xì)顆粒樣隆起。而造模組肝臟顏色灰暗，質(zhì)地較硬，體積縮小，表面分布大小不等的細(xì)顆粒樣結(jié)節(jié)(見圖2C、2F)。HE組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，造模后小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，假小葉形成。干細(xì)胞疏松，細(xì)胞內(nèi)脂肪變，部分細(xì)胞變性壞死(見圖2A、2D)。天狼星染色可見造模后肝內(nèi)紅染的纖維條索增多，粗細(xì)不等，假小葉形成(見圖2B、2E)。模型小鼠肝臟呈現(xiàn)典型的肝硬化病理表現(xiàn)。

圖1 MSCs鑒定和誘導(dǎo)分化 A：成骨誘導(dǎo)(100×)；B：成脂誘導(dǎo)(100×)；C：成軟骨誘導(dǎo)(40×)；D：流式細(xì)胞鑒定

2.3移植MSCs肝內(nèi)定植情況分析將40只小鼠隨機(jī)分成4組，分別接受尾靜脈移植、腹腔移植、門靜脈移植。移植3 d后，各組處死3只小鼠，取肝臟，冰凍切片制片，DAPI染色后行熒光顯微鏡觀察，并計(jì)算GFP+細(xì)胞所占比例。發(fā)現(xiàn)，肝臟中絕大多數(shù)移植的干細(xì)胞主要集中在小葉間的匯管區(qū)，只有少數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肝小葉的中央。GFP+定植分析顯示，IV組陽(yáng)性細(xì)胞比例為(4.65±0.68)%，IP組為(4.88±0.23)%，PV組為(5.04±0.77)%。提示這三種移植途徑MSCs肝內(nèi)定植數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖3)。

圖3 GFP+ MSCs肝內(nèi)定植(100×) A：對(duì)照組；B：IV組；C：IP組；D：PV組Fig 3 Distribution of GFP+ MSCs in liver (100×) A: control group; B: IV group; C: IP group; D: PV group

2.4移植后療效評(píng)價(jià)2周治療結(jié)束后，可見不同途徑移植MSCs小鼠精神、食欲均有所增加。肝臟外觀顆粒樣變化改善，而未移植干細(xì)胞組仍呈典型的肝硬化外觀。組織學(xué)上MSCs移植后肝內(nèi)假小葉數(shù)量減少，炎癥減輕。壞死肝細(xì)胞數(shù)量、浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞數(shù)據(jù)均有減少。天狼星染色發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)纖維束減少變細(xì)，組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)，纖維化改善。但從組織學(xué)上看，三種不同移植途徑的肝臟改善未見明顯區(qū)別(見圖4)。

圖4 MSCs移植后肝臟組織學(xué)比較(100×)Fig 4 Histology study of liver after MSCs transplantation (100×)

2.5移植后血清ALT、AST、ABL比較為進(jìn)一步比較不同MSCs移植后對(duì)肝功能的恢復(fù)情況，我們?nèi)⊙獙?duì)肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及白蛋白(ALB)合成水平進(jìn)行分析。三種移植途徑相對(duì)于未移植組ALT(586.9±27.29)U/L水平顯著降低。其中IV組(215.7±60.42)U/L(P<0.001)、PV組(232.5±82.0)U/L(P<0.001)、IP組(225.2±58.8)U/L(P<0.001)；相較于未移植組AST(667.9±75.85)U/L，三種移植途徑AST水平明顯下降，IV組(342.3±89.24)U/L(P<0.001)、PV組(379.4±61.57)U/L(P<0.01)、IP組(367.4±58.62)U/L(P<0.01)。同時(shí)，移植組ALB合成能力與未移植組(14.95±1.19)g/L相比顯著增強(qiáng)，其中IV組(21.15±1.68)g/L(P<0.01)、PV組(20.25±2.62)g/L(P<0.05)、IP組(21.07±1.02)g/L(P<0.01)。統(tǒng)計(jì)分析同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，三種不同的移植途徑組間差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖5)。

3 討論

肝硬化是我國(guó)常見病，傳統(tǒng)保肝為主的治療方法對(duì)終末期肝硬化治療效果有限。肝移植手術(shù)雖可以達(dá)到良好的效果，但因供體缺乏、手術(shù)費(fèi)高昂、需服用免疫排斥藥物等使得肝移植開展受限[10]。干細(xì)胞移植治療肝硬化近十年來發(fā)展很快，國(guó)內(nèi)外研究及應(yīng)用報(bào)道不斷增多。干細(xì)胞治療終末期肝病的有效性已被證實(shí)，同時(shí)干細(xì)胞治療具有免疫原性小、費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)[11-13]。

注：**P<0.01；***P<0.001;ns:P>0.05。圖5 MSCs移植后血清ALT、AST、ALB比較Fig 5 Comparison of ALT, AST and ALB after MSCs transplantation

然而對(duì)于影響干細(xì)胞定植的關(guān)鍵因素，細(xì)胞移植途徑對(duì)肝硬化治療效果的影響卻鮮有報(bào)道。

在治療終末期肝病的研究中使用的MSCs移植途徑主要有：外周靜脈(尾靜脈)、門靜脈、腹腔等方式,各方法均有特點(diǎn)。如外周靜脈法(動(dòng)物主要采用尾靜脈注射)：這種移植方式臨床及動(dòng)物研究報(bào)道最多，移植操作簡(jiǎn)單，不需要手術(shù)，對(duì)設(shè)備儀器要求低。但存在肺栓塞危險(xiǎn)、肺臟定植細(xì)胞較多等問題。門靜脈法：因肝臟供血主要來自門靜脈，為MSCs治療肝臟病特有的途徑。但該方法操作復(fù)雜，需要手術(shù)，也有肺栓塞危險(xiǎn)。腹腔注射法與前兩者不同，它的優(yōu)勢(shì)主要是操作簡(jiǎn)單，移植細(xì)胞數(shù)相對(duì)較多，不會(huì)發(fā)生肺栓塞等危險(xiǎn)。最近在炎癥性腸病研究[14-15]中發(fā)現(xiàn)，腹腔移植法較靜脈移植法有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此，我們選取了上述三種移植途徑進(jìn)行了比較。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，雖然三種細(xì)胞移植途徑不同，然而，在相同MSCs移植數(shù)量條件下，無論從組織學(xué)還是血清學(xué)變化，三種移植途徑的治療效果并沒有明顯差異。該研究結(jié)果與我們研究前的設(shè)想及我們既往在炎癥性腸病上的研究結(jié)果[14]不同。我們分析可能的原因有：(1)定植于肝臟的MSCs細(xì)胞數(shù)目基本相同。我們?cè)谝浦埠蟮?天對(duì)定植于肝臟的MSCs數(shù)目進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)各移植途徑間無明顯差異。因而在肝臟部位發(fā)揮作用的干細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)基本一致。我們實(shí)驗(yàn)前曾預(yù)想“門靜脈定植細(xì)胞最多，腹腔移植定位最少”，因?yàn)楦闻K血供約75%來自門靜脈，而腹腔由于遷移路徑限制，到達(dá)肝臟的肝細(xì)胞數(shù)量不多[16]。然而結(jié)果與我們的設(shè)想并不相同。MSCs的遷移與炎癥部位釋放的趨化因子相關(guān)[17]。可見MSCs的定植數(shù)量與肝臟本身的炎癥程度相關(guān)，與移植途徑關(guān)系并不密切；(2)除定植于肝臟的MSCs外，還有大量的MSCs定植于肝外部位，這些部位的干細(xì)胞通過旁分泌作用，分泌多種細(xì)胞因子，通過血液途徑到達(dá)肝臟，發(fā)揮調(diào)節(jié)和治療作用。而這類旁分泌作用不同移植途徑對(duì)其影響不大；(3)肝硬化的嚴(yán)重程度與MSCs治療劑量間的關(guān)系。如果肝硬化逆轉(zhuǎn)所需的最低MSCs數(shù)量遠(yuǎn)小于輸入數(shù)量MSCs所能及的最低療效，那么三種治療途徑的優(yōu)劣不能顯現(xiàn)出來。因此，在今后的實(shí)驗(yàn)中，我們還將對(duì)不同MSCs移植數(shù)量、不同肝硬化輕重程度的條件下研究移植途徑對(duì)于MSCs治療肝硬化療效的影響。

雖然MSCs具有定向分化為其他終末期細(xì)胞的能力，但是目前多數(shù)研究[14，18-20]認(rèn)為，MSCs發(fā)揮作用的模式為“hit and run”模式，多數(shù)MSCs會(huì)在48～72 h死亡或被清除出體內(nèi)。這與我們實(shí)驗(yàn)中觀察到的一致，移植后3 d我們尚能在肝臟觀察到部分GFP+MSCs定植，但7 d后肝臟已無GFP+MSCs定植(數(shù)據(jù)未展示)。因此，我們認(rèn)為，MSCs治療肝硬化的機(jī)制可能主要是通過旁分泌作用分泌大量抗炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，減輕炎癥反應(yīng)，抑制炎性細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞再生修復(fù)而發(fā)揮作用的[21]。而非定向分化成終末肝細(xì)胞起作用的。

雖然三種移植途徑并未見明顯的治療差異，但綜合MSCs治療肝硬化的可能機(jī)制及各移植途徑的優(yōu)缺點(diǎn)，我們初步認(rèn)為，腹腔注射法最有發(fā)展前景。因其操作最簡(jiǎn)單、方便；同時(shí)不易發(fā)生肺栓塞，危險(xiǎn)性?。患?xì)胞移植數(shù)量上可選的安全范圍大，可移植較多數(shù)量細(xì)胞；腹腔內(nèi)小血管密布，便于干細(xì)胞發(fā)揮旁分泌作用；同時(shí)，MSCs可在腹腔內(nèi)與炎癥細(xì)胞形成“細(xì)胞小體”(aggregates)，可進(jìn)一步增強(qiáng)其旁分泌和免疫調(diào)節(jié)作用[22]。然而以上結(jié)論仍需深入的基礎(chǔ)和臨床研究驗(yàn)證，方可得出科學(xué)結(jié)論。