HDAC1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡及侵襲能力的影響

李青云， 肖 鵬， 司徒偉基， 蔡思思

1.香港大學(xué)深圳醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 深圳 518000； 2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，是世界第三大惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于乳腺癌、肺癌，再加上其轉(zhuǎn)移快、預(yù)后差，結(jié)直腸癌嚴(yán)重影響人類的生命健康[1]。腫瘤的發(fā)生與癌基因過度表達(dá)和抑癌基因表達(dá)缺失有關(guān)，是一個(gè)復(fù)雜的過程，隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，基因靶向治療腫瘤已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)[2]。組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylases 1，HDAC1)編碼的蛋白在組蛋白及非組蛋白的乙?；芯哂嘘P(guān)鍵作用，能夠調(diào)控核小體結(jié)構(gòu)的改變和DNA的轉(zhuǎn)錄，能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)特性的發(fā)揮[3]。研究[4-6]顯示，HDAC1在結(jié)直腸癌、腎透明癌等多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，且可以調(diào)控卵巢癌等多種癌細(xì)胞的凋亡、侵襲等過程，可能是一種癌基因。本實(shí)驗(yàn)用結(jié)直腸癌細(xì)胞為研究對(duì)象，通過小RNA干擾技術(shù)下調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中HDAC1的表達(dá)，以明確HDAC1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡、侵襲等的作用，為以后研究HDAC1在腫瘤中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料結(jié)直腸癌細(xì)胞Caco2購自上海JINDU公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；HDAC1 siRNA和siRNA control購自上海Seebio；熒光定量PCR試劑盒購自大連TAKARA公司；HDAC1多克隆抗體購自英國Abcam公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease 9，MMP-9)多克隆抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)多克隆抗體購自美國Cell signaling公司；Cleaved caspase-3多克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotease 2，MMP-2)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組Caco2細(xì)胞生長密度約為70%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染前1 h用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育，用Lipofectamine 2000將HDAC1 siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，步驟參照試劑盒說明書，將轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA和siRNA control后的細(xì)胞命名為HDAC1 siRNA和siRNA-NC，以不做轉(zhuǎn)染的細(xì)胞命名為Control。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，qRT-PCR和Western blotting檢測細(xì)胞中的HDAC1表達(dá)水平。

1.3qRT-PCR檢測HDAC1mRNA表達(dá)Control、siRNA-NC、HDAC1 siRNA細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后，根據(jù)RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，RNA保存在-70 ℃條件下。用分光光度計(jì)測定所提取的各組細(xì)胞中的RNA的濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR。HDAC1引物上游序列：5′-AACTGGGGACCTACGG-3′，下游序列：5′-ACTTGGCGTGTCCTT-3′。GAPDH上游序列：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游序列：5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′。

1.4Westernblotting檢測HDAC1蛋白表達(dá)Control、siRNA-NC、HDAC1 siRNA細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，把培養(yǎng)液棄去，添加細(xì)胞裂解液，把培養(yǎng)板放在冰上，30 min后，用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，將裂解液轉(zhuǎn)移到離心管中，在低溫離心機(jī)中，12 000×g離心5 min。取離心之后的上清，-20 ℃保存。用BCA法檢測蛋白濃度。把蛋白與上樣緩沖液混合后，100 ℃煮沸5 min。每孔40 μg蛋白樣品，60 V電壓電泳，觀察溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的邊緣以后停止電泳。轉(zhuǎn)膜：60 V轉(zhuǎn)膜2 h。孵育抗體：把膜放在質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉中反應(yīng)1 h，TBST洗膜2次以后，再把膜放在1∶800稀釋的一抗中室溫孵育2 h后，TBST洗膜2次，把膜放在1∶2 000稀釋的二抗中室溫孵育2 h，TBST洗膜2次。ECL發(fā)光以后，凝膠圖像分析儀測定條帶的光密度值，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白的水平。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡Control、siRNA-NC、HDAC1 siRNA細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用胰蛋白酶消化后，加入PBS洗滌2次細(xì)胞后，在室溫條件下800×g離心5 min，把上清吸除以后，在細(xì)胞中添加100 μl的緩沖液，再加入5 μl的碘化丙啶(propidium iodide，PI)和膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)，混合后，再添加400 μl的緩沖液，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.6Transwell小室測定細(xì)胞侵襲和遷移Transwell在侵襲實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠濕化30 min，Control、siRNA-NC、HDAC1 siRNA細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)液懸浮后，在小室的上室中添加300 μl的細(xì)胞懸浮液，在下室中添加600 μl的含有胎牛血清的培養(yǎng)液，在37 ℃孵育24 h以后，將膜上沒有侵襲的細(xì)胞擦掉以后，用質(zhì)量濃度為950 g/L的甲醇固定20 min后，用質(zhì)量濃度為2.5 g/L的結(jié)晶紫在室溫中染色30 min。觀察計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。用Transwell小室檢測細(xì)胞遷移，遷移實(shí)驗(yàn)不用基質(zhì)膠濕化，其他步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.7Westernblotting法測定細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Bax、Cleavedcaspase-3蛋白水平Control、siRNA-NC、HDAC1 siRNA細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，Western blotting方法測定MMP-2、MMP-9、Bax、Cleaved caspase-3在各組細(xì)胞中的表達(dá)水平，步驟同上。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中HDAC1的表達(dá)HDAC1 siRNA細(xì)胞中HDAC1 mRNA和蛋白水平均明顯低于Control，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siRNA-NC細(xì)胞中HDAC1 mRNA和蛋白水平與Control相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HDAC1 siRNA可以降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中HDAC1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)(見圖1、表1)。

2.2下調(diào)HDAC1誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡HDAC1 siRNA細(xì)胞凋亡率明顯高于Control，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siRNA-NC細(xì)胞凋亡率與Control相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。下調(diào)表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡(見圖2、表2)。

圖1 Western blotting測定HDAC1蛋白在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá)Fig 1 The expression of HDAC1 protein in transfected cells detected by Western blotting

組別HDAC1 mRNAHDAC1蛋白Control1.001.05±0.16siRNA-NC0.95±0.161.06±0.12HDAC1 siRNA0.19±0.02&0.27±0.04&F值71.31944.445P值0.0000.000

注：與Control比較，&P<0.05。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)測定HDAC1表達(dá)下調(diào)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響Fig 2 Flow cytometry to determine the effect of down-regulation of HDAC1 expression on the apoptosis of colorectal cancer cells

組別凋亡率/%Control6.99±0.54siRNA-NC7.31±0.82HDAC1 siRNA38.24±2.17&F值511.201P值0.000

注：與Control比較，&P<0.05。

2.3下調(diào)HDAC1降低結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力HDAC1 siRNA細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目明顯低于Control，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siRNA-NC細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目與Control相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。下調(diào)HDAC1表達(dá)可以降低結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力(見表3)。

表3 各組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目Tab 3 The number of cell migration and invasion in each

注：與Control比較，&P<0.05。

2.4下調(diào)HDAC1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Bax、Cleavedcaspase-3蛋白水平影響HDAC1 siRNA細(xì)胞中MMP-2、MMP-9水平明顯低于Control，Bax、Cleaved caspase-3水平明顯高于Control，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siRNA-NC細(xì)胞MMP-2、MMP-9、Bax、Cleaved caspase-3水平與Control相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。下調(diào)HDAC1表達(dá)可以降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)Bax、Cleaved caspase-3的表達(dá)(見圖3、表3)。

圖3 Western blotting法測定HDAC1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、Bax、Cleaved caspase-3蛋白水平Fig 3 Determination of MMP-2, MMP-9, Bax and Cleaved caspase-3 protein levels in cells after down-regulation of HDAC1 expression by Western blotting

組別MMP-2MMP-9BaxCleaved caspase-3Control0.87±0.050.64±0.050.69±0.090.28±0.03siRNA-NC0.89±0.070.62±0.080.70±0.070.27±0.05HDAC1 siRNA0.20±0.02&0.13±0.02&1.13±0.12&0.92±0.09&F值177.96280.74220.726108.548P值0.0000.0000.0020.000

注：與Control比較，&P<0.05。

3 討論

HDACs蛋白家族含有多個(gè)成員，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有18種HDACs，其中HDAC1在人類的多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，能夠增加腫瘤細(xì)胞的增殖活性，且能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[7]。在胰腺癌組織中發(fā)現(xiàn)，HDAC1的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于胰腺癌旁組織，后續(xù)在肺癌、前列腺癌、宮頸癌等中也發(fā)現(xiàn)HDAC1的高表達(dá)[8-11]。GLASER等[12]通過小RNA干擾技術(shù)下調(diào)多種HDACs的表達(dá)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDAC1在腫瘤細(xì)胞生長、凋亡等過程中必不可少。降低卵巢癌細(xì)胞中HDAC1的表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力下降[6]。研究[4]顯示，HDAC1在結(jié)直腸癌中表達(dá)升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HDAC1表達(dá)下調(diào)后的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞侵襲和遷移能力下降，HDAC1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮癌基因的作用。

惡性腫瘤易轉(zhuǎn)移，而癌細(xì)胞的侵襲和遷移是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的重要原因。細(xì)胞外基質(zhì)是腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的屏障，在腫瘤向鄰近部位轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生能夠分解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供條件[13-15]。基質(zhì)金屬蛋白酶是腫瘤侵襲和遷移的重要蛋白酶，其激活可以降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分，MMP-2和MMP-9主要降解V、Ⅳ型膠原酶，是目前研究的與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的基質(zhì)金屬蛋白酶[16]。MMP-2和MMP-9在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，而下調(diào)MMP-2和MMP-9水平均可以降低腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HDAC1表達(dá)下調(diào)后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均明顯降低，提示HDAC1可以通過影響MMP-2、MMP-9的表達(dá)調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

細(xì)胞凋亡在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有重要作用，是由基因調(diào)控所引發(fā)的自然死亡，與細(xì)胞內(nèi)的多種調(diào)控因子有關(guān)，死亡受體途徑和線粒體途徑是細(xì)胞凋亡發(fā)生的經(jīng)典途徑，與細(xì)胞內(nèi)的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)和Bcl-2蛋白家族有關(guān)[18]。Caspase-3位于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，屬于效應(yīng)因子，其通過酶原的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，其在激活時(shí)被剪切形成活化形式的Cleaved caspase-3，發(fā)揮凋亡促進(jìn)的作用[19]。Bcl-2蛋白家族與Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)相互結(jié)合，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，其在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)[20]。本實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)HDAC1后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中Bax表達(dá)水平升高，細(xì)胞中Cleaved caspase-3水平也升高，說明HDAC1表達(dá)下調(diào)可以通過促進(jìn)Bax表達(dá)和Caspase-3活化誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。

以上表明，HDAC1表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡，降低結(jié)直腸細(xì)胞的侵襲和遷移能力，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Caspase-3的活化，降低細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)，HDAC1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮癌基因的作用。本研究為探討HDAC1在結(jié)直腸癌中的作用提供了理論基礎(chǔ)，為臨床上靶向HDAC1治療結(jié)直腸癌提供了理論參考。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)在多株結(jié)直腸癌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)于其具體的作用機(jī)制仍需要在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中探討。