激光透明帶薄化技術(shù)在凍融胚胎和高齡婦女新鮮胚胎移植中的應(yīng)用研究

石 燕，葛 斌，楊智敏，楊 靖，楊名慧（遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖中心，貴州遵義563003）

隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，如何提高胚胎的種植率和妊娠率是現(xiàn)階段的熱點問題。胚胎從透明帶中順利孵出是著床的先決條件。已有研究發(fā)現(xiàn)，胚胎在凍融和體外培養(yǎng)過程中均會產(chǎn)生透明帶變厚、變硬的情況，從而導(dǎo)致胚胎孵出困難[1]。激光透明帶薄化術(shù)是一種輔助孵化技術(shù)，其原理是使用激光將透明帶削薄，有利于胚胎從透明帶中孵出，進而著床的一種顯微操作技術(shù)[2]。而該技術(shù)在操作過程中激光產(chǎn)生的熱能是否會對胚胎卵裂球產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致流產(chǎn)率增加，目前尚存爭議。本研究回顧性分析激光透明帶薄化技術(shù)對凍融胚胎和高齡婦女新鮮胚胎臨床結(jié)局的影響，以探討此技術(shù)在胚胎移植中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2016年11月在本中心進行凍融胚胎移植和新鮮胚胎移植患者凍融胚胎179周期共胚胎406枚作為研究對象，其中117周期共263枚胚胎行透明帶薄化技術(shù)，其余62周期共143枚胚胎未行透明帶薄化術(shù)；高齡婦女（≥37歲）新鮮胚胎84周期共217枚胚胎，其中52周期共135枚新鮮胚胎行激光透明帶薄化術(shù)，32周期共82枚胚胎未行削薄術(shù)，按照是否行激光透明帶薄化術(shù)分為薄化組合對照組，并排除子宮肌瘤、生殖系統(tǒng)畸形、染色體異常等影響胚胎著床或造成流產(chǎn)的因素。

1.2 方法

1.2.1 促排卵與取卵 采用本中心常規(guī)長方案、短方案或拮抗劑進行促排卵，最大卵泡直徑大于或等于18 mm，其余有3個卵泡直徑大于或等于16 mm，子宮內(nèi)膜厚度大于或等于8 mm時，當天停用促卵泡發(fā)育藥物，注射人絨毛膜促性腺激素（HCG）10 000 U，36 h后在陰道B超下穿刺取卵。

表1 兩組一般資料比較

表2 兩組高齡婦女新鮮胚胎比較

1.2.2 體外受精與移植 根據(jù)精液情況和適應(yīng)證進行常規(guī)體外受精（IVF）或單精子卵胞質(zhì)內(nèi)注射（ICSI）操作，受精后66～68 h進行胚胎移植，剩余胚胎冷凍保存。

1.2.3 胚胎冷凍與復(fù)蘇

1.2.3.1 胚胎冷凍 冷凍試劑采日本KITAZATO玻璃化試劑盒；冷凍方法：將胚胎轉(zhuǎn)移到羥乙基哌嗪乙硫黃酸（HEPES）緩沖液停留1 min，然后在平衡溶液中脫水2 min，最后轉(zhuǎn)移至玻璃化溶液停留30 s后裝載到載桿上直接投入液氮中保存。

1.2.3.2 胚胎復(fù)蘇 將胚胎從液氮罐中取出以此放入0.5 mol/L蔗糖溶液和0.35 mol/L蔗糖溶液中各停留1 min，再轉(zhuǎn)移至0.25 mol/L蔗糖溶液中反脫水3 min，最后在HEPES緩沖液中洗滌數(shù)次，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2.3 激光透明帶薄化技術(shù) 將胚胎置于覆蓋礦物油的培養(yǎng)滴內(nèi)，在倒置顯微鏡下使用美國Hamilton Thorne公司生產(chǎn)的ZILOS-TK激光顯微操作系統(tǒng)，先測量透明帶的厚度，然后發(fā)射1 480 nm波長紅外激光進行透明帶薄化處理。削薄胚胎透明帶厚度的70%～80%直至內(nèi)側(cè)致密層，每次薄化長度設(shè)定為7.1～7.5μm，總薄化長度約為透明帶周長的1/4，操作結(jié)束后將胚胎洗滌數(shù)次后置于培養(yǎng)箱內(nèi)待移植。

1.2.4 妊娠判定 移植后14 d檢查HCG，若為陽性于25～35 d進行B超檢查孕囊，并隨訪直至分娩。

1.2.5 觀察指標 胚胎種植率=種植胚胎總數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；妊娠率=妊娠周期數(shù)/總周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗，率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組平均年齡、子宮內(nèi)膜厚度、移植個數(shù)和流產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而薄組種植率和妊娠率均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組高齡婦女新鮮胚胎比較 兩組間平均年齡、子宮內(nèi)膜厚度、移植個數(shù)和流產(chǎn)率，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），薄化組種植率和妊娠率均顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 討 論

胚胎是否能從透明帶中順利孵出是決定輔助生殖成功率的重要條件。在自然受孕過程中，胚胎孵出主要依賴于滋養(yǎng)細胞和消化蛋白酶溶解透明帶而完成，而在促排卵、體外受精和胚胎冷凍過程中，由于胚胎長時間暴露在體外環(huán)境中，尤其是凍融胚胎移植患者和高齡婦女，溫度、濕度等劇烈變化會造成透明帶變厚、變硬或畸形，從而導(dǎo)致胚胎孵出困難，嚴重影響輔助生殖的成功率[3]。

激光透明帶薄化術(shù)是近年來新興的一種輔助孵化技術(shù)，相對于透明帶鉆孔術(shù)而言，具有防止卵裂球污染、丟失、嵌頓、免疫學疾病等優(yōu)點[4]。本研究在觀察凍融胚胎患者中，排除年齡、子宮內(nèi)膜厚度、移植個數(shù)等影響胚胎臨床結(jié)局的因素，發(fā)現(xiàn)行激光透明帶薄化術(shù)的胚胎其種植率和妊娠率均顯著高于對照組，與谷瑞環(huán)等[5]的研究結(jié)果一致，但 VALOJERDI等[6]和陳曦等[的研究結(jié)果相反，分析其原因可能為：（1）由于研究對象的臨床情況、胚胎質(zhì)量和冷凍方法的差異而導(dǎo)致的結(jié)果不同；（2）由 VALOJERDI等[6]在研究過程中，只削薄了透明帶的外層，而導(dǎo)致胚胎孵出困難的致密層卻完整保留。本研究對透明帶厚度的削薄范圍達到了70%～80%，并且只保留了1/3的致密層，因此導(dǎo)致試驗結(jié)果有差異。

在對高齡婦女新鮮胚胎的研究中，薄化組種植率和妊娠率均顯著高于對照組，與鄧志華等[8]研究結(jié)果不同，但與張建瑞等[9]的研究結(jié)果一致，除了樣本量、胚胎質(zhì)量和患者激素存在差異外，最可能的原因是高齡婦女的胚胎發(fā)育潛能、孵出能力比較差，即使行激光透明帶薄化術(shù)也不能顯著改善其臨床結(jié)局。

國外有學者研究認為，激光透明帶削薄術(shù)并不能提高非高齡婦女新鮮胚胎的妊娠率[10]。因此，本中心暫時未對此類型婦女新鮮胚胎進行常規(guī)的透明帶削薄術(shù)。MARTINS等[11]和唐永梅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)促卵泡生成激素（FSH）值和胚胎碎片含量對新鮮胚胎的孵出也有影響，本中心下一步將對FSH值大于15 U/mL、胚胎碎片大于20%和反復(fù)移植失敗的非高齡婦女新鮮胚胎行激光透明帶削薄術(shù)，以進一步明確該技術(shù)對此類患者臨床結(jié)局的影響。

在激光透明帶削薄術(shù)操作中，削薄的位置和長度是十分重要的，但要注意削薄的位置，應(yīng)盡量遠離卵裂球，從而最大限度地避免卵裂球不被激光的熱量灼傷，且削薄的長度要足夠長，一般為80μm，以避免孵出時形成嵌頓。

綜上所述，激光透明帶薄化技術(shù)能有效改善凍融胚胎的臨床結(jié)局，且不會增加流產(chǎn)風險。雖然本研究結(jié)果顯示，該技術(shù)能顯著增加高齡婦女新鮮胚胎移植結(jié)局的影響，但由于樣本量較小，其效果仍需加大樣本量做進一步研究。