仙靈骨葆膠囊對大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和血小板衍生生長因子表達的影響*

秦桂芳 李霞清

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000）

骨質(zhì)疏松癥屬全身性、代謝性骨骼系統(tǒng)多基因疾病，多發(fā)生于老年人，如絕經(jīng)后婦女和老年男性性腺機能減退者，臨床表現(xiàn)為骨量和骨密度進行性下降，因骨微結(jié)構(gòu)破壞并由此導(dǎo)致骨強度下降及骨脆性增加，故骨質(zhì)疏松癥患者極易發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折[1]。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴(yán)重并發(fā)癥，是我國人口老齡化后的重要的公共健康問題[2]。臨床上骨質(zhì)疏松性骨折多指原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨折，屬脆性骨折，骨折部位以髖部、肱骨近端、脊柱及橈尺骨遠端常見[3]。臨床治療老年男性因性腺功能減退造成骨密度（BMD）下降者常采用睪酮肌內(nèi)注射或口服十一酸睪酮進行激素代替療法，但睪酮替代療法可能造成肝腎功能受損并增加前列腺增生和前列腺癌的發(fā)生風(fēng)險，故激素代替療法有一定的局限性[4]。本實驗選用雄性去勢SD大鼠造模，可相對真實反映男性性腺機能減退導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折的病理改變和病理進程，選用治療骨質(zhì)疏松癥的中成藥仙靈骨葆膠囊作為研究對象來進行實驗研究，以期為臨床治療骨質(zhì)疏松性骨折提供理論依據(jù)，對臨床用藥起到指導(dǎo)作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠共96只，雄性，體質(zhì)量160～180 g，實驗動物由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物房提供（鄂 20170331）。

1.2 試藥與儀器 SG-51正置型金相顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；X射線骨密度儀購自天津圣鴻醫(yī)療器械有限公司；圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）；仙靈骨葆膠囊（貴州同濟堂制藥有限公司，批號：C201710122124）；BMP-2、PDGF 和 TIMP-1 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；D-半乳糖注射液購自北京索萊寶生物科技有限公司；水合氯醛購自揚州市奧鑫助劑廠。

1.3 造模及分組 96只中隨機選取72只大鼠，先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，參照孫巖[5]的研究方法，于去勢手術(shù)的同時頸部皮下注射D-半乳糖（100 mg/kg）的方法建立大鼠骨質(zhì)疏松模型。另取24只正常大鼠設(shè)為假手術(shù)組，不手術(shù)造模。手術(shù)前腹腔注射1%水合氯醛（0.5 mL/100 g）深度麻醉大鼠，然后固定于小動物手術(shù)臺，用10%硫化鈉脫去下腹部及陰囊處鼠毛并消毒，鋪無菌巾，切開陰囊皮膚，分離精索并找到睪丸，結(jié)扎精索及血管后切除雙側(cè)睪丸，然后逐層縫合、消毒。然后按100 mg/kg劑量頸部皮下注射D-半乳糖。因本手術(shù)嚴(yán)格按無菌操作，故術(shù)后無需使用抗生素預(yù)防感染。8周后用X射線骨密度儀測量大鼠骨密度（BMD），篩選其中BMD較假手術(shù)組明顯降低的大鼠再采用手術(shù)折斷右側(cè)股骨干中段制備骨質(zhì)疏松性骨折模型，本實驗在造模期間無動物死亡，所有動物經(jīng)X射線骨密度儀篩選均合格（造模成功）。將成模的72只大鼠采用隨機數(shù)字表編號，然后隨機分為模型組、睪酮組和干預(yù)組，另取24只正常大鼠設(shè)為假手術(shù)組，不手術(shù)造模用以空白對照。

1.4 干預(yù)方法 干預(yù)組給予仙靈骨葆250 mg/（kg·d），每日2次灌胃；睪酮組給予十一酸睪酮2 mg/（kg·d），每日2次灌胃；假手術(shù)組和模型組予等量0.9%氯化鈉注射液每日2次灌胃。以上各組均干預(yù)18周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 分別于治療第5、9、18周取每組中的8只大鼠靜脈血1 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法測定大鼠靜脈血PDGF。檢測時取樣品于室溫放置2 h，1000×g 離心 20 min，取上清，取出酶標(biāo)板，按照標(biāo)準(zhǔn)品的次序分別加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中?？瞻孜⒖字屑尤?0 μL的樣品，空白對照加入100 μL的蒸餾水。在各孔中加入100 μL的酶標(biāo)記溶液（不含空白對照孔）。將酶標(biāo)板用封口膠密封后，37℃孵育反應(yīng)1 h（在孵育箱中保持穩(wěn)定的溫度與濕度）。充分清洗酶標(biāo)板5次，保持各孔有充足的水壓（濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋。酶標(biāo)板洗滌后用吸水紙徹底拍干。各孔加入顯色劑A和顯色劑B 50 μL，20～25℃下避光反應(yīng)15 min。然后各孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。將酶標(biāo)儀波長調(diào)至450nm讀取樣品OD，再以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用curve expert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并讀取樣品濃度。PGI2、PGE2的酶聯(lián)免疫吸附試驗法參考以上步驟嚴(yán)格按測試盒說明進行實驗。取血后處死動物，取骨痂和關(guān)節(jié)軟骨組織采用免疫組織化學(xué)染色法分別檢測大鼠，BMP-2及TIMP-1的表達，采用骨密度儀測量大鼠BMD。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立樣本的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠BMD及BMP-2蛋白表達比較 見表1。假手術(shù)組第5、9、18周時BMD及BMP-2蛋白表達保持不變。模型組第5、9、18周BMD均較假手術(shù)組低（P＜0.05），但BMP-2表達雖有一定程度增強，但與假手術(shù)組比較差異不明顯 （P＞0.05）。睪酮組第5、9、18周BMD均明顯提高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），十一酸睪酮對BMP-2表達無明顯影響，與假手術(shù)組和模型組比較差異不明顯（P＞0.05）。而干預(yù)組與模型組比較第18周時BMD明顯提高（P＜0.05），但BMD提高程度無睪酮組明顯（P＜0.05）；第9、18周BMP-2高表達，與假手術(shù)組、模型組和睪酮組比較差異明顯（P＜0.05）。

表1 各組大鼠BMD及BMP-2蛋白表達比較（±s）

表1 各組大鼠BMD及BMP-2蛋白表達比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，與模型組比較，△P＜0.05；與睪酮組比較，▲P＜0.05。 下同

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2.2 各組大鼠PDGF及TIMP-1蛋白表達比較 見表2。假手術(shù)組第5、9、18周時PDGF及TIMP-1蛋白表達保持不變。模型組PDGF在第5、9、18周均保持較高水平，與假手術(shù)組比較差異明顯（P＜0.05），但TIMP-1與假手術(shù)組比較差異不明顯（P＞0.05）。睪酮組PDGF及TIMP-1蛋白表達變化規(guī)律與模型組相似，提示十一酸睪酮對PDGF及TIMP-1蛋白表達無明顯影響，兩者與假手術(shù)組和模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組、模型組和睪酮組比較，干預(yù)組第5、9周PDGF明顯升高（P＜0.05），但到第18周時PDGF則降至假手術(shù)組水平，與模型組和睪酮組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第 9、18 周 TIMP-1 均高表達，與假手術(shù)組、模型組和睪酮組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠PDGF水平和TIMP-1蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠PDGF水平和TIMP-1蛋白表達比較（±s）

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2.3 各組大鼠PGI2與PGE2含量的比較 見表3。模型組第5、9、18周PGI2和PGE2均保持較高水平，與假手術(shù)組比較差異明顯 （P＜0.05）。睪酮組第5、9周PGI2和PGE2明顯升高，與假手術(shù)組和模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），第 18周時PGI2和 PGE2則降至假手術(shù)組水平，與模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而干預(yù)組PGI2和PGE2變化規(guī)律與睪酮組相似，在第5、9周PGI2和PGE2明顯升高，與假手術(shù)組和模型組比較差異明顯（P＜0.05），但兩者升高程度無睪酮組明顯，與睪酮組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在第18周時PGI2和PGE2則均降至假手術(shù)組水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但兩者與睪酮組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠PGI2和PGE2含量比較（ng/L，±s）

表3 各組大鼠PGI2和PGE2含量比較（ng/L，±s）

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3 討 論

仙靈骨葆膠囊是骨質(zhì)疏松癥及骨折等常用非處方藥，收錄于2009年《國家基本藥物目錄》，主要由淫羊藿、補骨脂、川續(xù)斷、地黃等中藥組成，具有滋補肝腎、強筋壯骨、活血通絡(luò)之功效[6]。大量基礎(chǔ)及臨床醫(yī)學(xué)研究表明，仙靈骨葆膠囊可提高骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折后骨量、增加骨密度和骨強度，可顯著改善骨質(zhì)疏癥及骨質(zhì)疏松性骨折局部血流、調(diào)節(jié)組織鈣磷代謝、促進鈣沉積并抑制骨吸收，對加速軟骨性骨痂向骨性骨痂的轉(zhuǎn)化起到促進作用[7-8]。因其對骨質(zhì)疏松癥及骨質(zhì)疏松性骨折等骨傷科疾病有顯著的防治作用，常用于骨折、骨質(zhì)疏松癥、骨質(zhì)疏松性骨折、骨無菌壞死及骨關(guān)節(jié)炎等的防治，是骨質(zhì)疏松癥及骨折的首選中藥制劑[9]。

骨質(zhì)疏松癥患者激素水平改變及鈣、磷代謝發(fā)生紊亂、成骨細胞活動減弱而骨吸收增強造成骨量逐步丟失，骨量、骨密度和骨強度降低，導(dǎo)致骨折的概率增大[10-11]。研究表明，在骨質(zhì)疏松性骨折的愈合不同階段，BMP-2和PDGF均起到重要的調(diào)節(jié)作用。PDGF在膜內(nèi)成骨時可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化及促進成骨細胞增殖的作用，還可以誘導(dǎo)受損血管內(nèi)皮細胞和上皮細胞的分裂與增殖，促進損傷組織血管的形成與再生以加速創(chuàng)傷修復(fù)[12-13]。PDGF主要貯存在血小板α顆粒中，是一種堿性蛋白質(zhì)，PDGF參與前列腺素代謝和磷酸酯酶激活過程，PDGF與有相應(yīng)受體的細胞作用時能誘導(dǎo)磷酸酰肌醇循環(huán)，促進花生四烯酸釋放和PGI2、PGE2的生成。研究表明，增加PGE2和PGI2可能加速骨吸收，并增加其抗血小板及擴血管以的活性，因此，在骨折的愈合不同階段，PGE2和PGI2起到不同作用[14]。另外，PDGF還可通過上調(diào)TIMP-1抑制膠原酶達到抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-10合成的目的，其含量與基質(zhì)金屬蛋白酶-10負相關(guān)，其機制可能是通過整合激素途徑參與骨質(zhì)疏松癥骨代謝高轉(zhuǎn)換過程并減少細胞外基質(zhì)的降解而保護關(guān)節(jié)面和關(guān)節(jié)軟骨[15-16]。BMP-2是最強的骨成長因子，能夠刺激和誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞在骨組織形成區(qū)的分化和增生，刺激成骨細胞分化增殖，增強成骨細胞活性而增加骨量、加速骨重建以促進骨折愈合[17-18]。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)模型組BMD均較假手術(shù)組低，且PDGF、PGI2和PGE2在20周內(nèi)均保持較高水平，而第5、9、18周BMP-2和TIMP-1表達均有一定程度增強。這一結(jié)果提示大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型是成功的，這在本實驗中有對照意義。造模使大鼠PDGF、PGI2和PGE2升高，前已述及，PDGF升高可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化及促進成骨細胞增殖的作用，PGI2和PGE2升高有利于增加其抗血小板及擴血管以的活性，促進骨折區(qū)域組織修復(fù)，但PGE2和PGI2增加又有可能加速骨吸收，這又會降低骨量、加重骨質(zhì)疏松，這也是模型組第5、9、18周BMD均較假手術(shù)組低的原因之一。觀察發(fā)現(xiàn)，十一酸睪酮對BMP-2、PDGF及TIMP-1蛋白表達無明顯影響，睪酮組第5、9、18 周 BMD 均明顯提高，PGI2 和 PGE2 在第 5、9周明顯升高，第18周時PGI2和PGE2則明顯降低，說明十一酸睪酮僅對BMD、PGI2和PGE2有明顯的影響。而干預(yù)組第18周時BMD明顯提高，但BMD提高程度沒有睪酮組明顯；與假手術(shù)組、模型組和睪酮組比較，干預(yù)組PDGF在第5、9周明顯升高，但PDGF在第18周時明顯降低，BMP-2和TIMP-1在第9、18周均高表達；PGI2和PGE2在第5、9周明顯升高，但兩者升高程度無睪酮組明顯，到第18周時兩者則明顯降低。這一結(jié)果提示仙靈骨葆膠囊在骨質(zhì)疏松性骨折愈合不同階段的作用不同，仙靈骨葆提高雄性去勢骨質(zhì)疏松性骨折大鼠BMD的作用與十一酸睪酮相似，但這一作用主要通過調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松性骨折愈合不同階段BMP-2、TIMP-1和 PDGF的表達與 PGI2和 PGE2合成來實現(xiàn)。從實驗結(jié)果來看，仙靈骨葆在骨折初期（第5、9 周）可上調(diào) PDGF、BMP-2 和 TIMP-1，作為骨成長因子，BMP-2增高可刺激和誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞在骨組織形成區(qū)的分化和增生，刺激成骨細胞分化增殖，增強成骨細胞活性而增加骨量、加速骨重建以促進骨折愈合[19-20]。 同時，在骨折初期（第 5、9 周），仙靈骨葆通過上調(diào)PDGF和TIMP-1的，一方面刺激PGI2和PGE2合成，增加其抗血小板及擴血管以的活性，另一方面通過上調(diào)TIMP-1抑制膠原酶來抑制抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-10合成，減少骨吸收及細胞外基質(zhì)的降解而達到保護關(guān)節(jié)功能的作用。但高含量的PGE2和PGI2可能加速骨吸收，故在骨折愈合后期（第18周）PDGF、PGI2和PGE2則降至假手術(shù)組水平，這說明仙靈骨葆膠囊參與了骨質(zhì)疏松性骨折愈合不同階段中各種因子間相互作用的復(fù)雜過程，這一過程還有待于進一步實驗研究來揭示。