柴胡三參膠囊對(duì)p38MAPK通路介導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化的干預(yù)研究*

劉建和 趙吉銳 雷婁芳 楊成龍 曾 英 王 敏

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

近年來，心血管疾病已成為我國人群的主要死亡原因之一[1]，其中急性缺血性心律失常是心血管病極度普遍的臨床表現(xiàn)類型[2]，臨床風(fēng)險(xiǎn)重大，可加重基礎(chǔ)心臟疾病，并能導(dǎo)致心源性猝死。目前，藥物治療仍是缺血性心律失常的主要治療手段，但抗心律失常藥的諸多不良反應(yīng)始終限制其臨床運(yùn)用[3]，隨著認(rèn)識(shí)水平的提高，心律失常的治療逐漸以控制原發(fā)病，調(diào)控心臟基本狀況為重點(diǎn)，如保證充足血供、穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)狀況等比醫(yī)治心律失常自身更為緊要。且藥物研究逐漸由組織器官水平向細(xì)胞水平發(fā)展，干細(xì)胞移植治療心肌缺血及由此誘發(fā)的心律失常得到了越來越多的關(guān)注與研究。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是從骨髓中篩選的已提交心肌譜系的多能成體干細(xì)胞，在某些誘導(dǎo)劑作用下可分化成心肌細(xì)胞，延緩心臟重構(gòu)，保證細(xì)胞的正常功能，促進(jìn)損傷心肌的修復(fù)[4]，這無疑在心律失常的治療中擁有重要的運(yùn)用前景。柴胡三參膠囊抗心律失常效果明顯[5-8]，且在前期研究中發(fā)現(xiàn)，其能明顯減少缺血性心律失常大鼠心肌中PKA、PKC的表達(dá)及血清CRP水平，表明其對(duì)心肌急性損傷具有保護(hù)作用[9]，此外，柴胡三參膠囊還能明顯減少大鼠心肌細(xì)胞HERG K+通道蛋白的失活，減少快速型室性心律失常的出現(xiàn)[10]。本研究旨在通過對(duì)柴胡三參膠囊促進(jìn)BMSCs分化為心肌細(xì)胞后p38MAPK、MEF2C及CTnT表達(dá)程度影響的研究，佐證柴胡三參膠囊能夠通過促進(jìn)誘導(dǎo)劑與受體結(jié)合激活p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞的分化從而起到抗心律失常的作用，并為更為深入探討柴胡三參膠囊抗心律失常的信號(hào)機(jī)制拓寬思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

P1代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞株，購自贏潤生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí) SD 大鼠 20只，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，普通飼料喂養(yǎng)，定期更換墊料，自由攝食，購自天勤動(dòng)物公司，許可證號(hào)：SYXK（湘）2014-0011。

1.3 試藥與儀器

柴胡三參膠囊（由柴胡、法半夏、黃連、黨參、丹參、苦參、青蒿、甘草組成，劑量比例 15∶10∶6∶15∶10∶10∶10∶6，每粒膠囊質(zhì)量為0.4 g）。特級(jí)胎牛血清（美國hyclone公司），青、鏈霉素（武漢貝茵萊生物科技有限公司），培養(yǎng)基（美國hyclone公司），水合氯醛（普盛藥業(yè)有限公司），PBS粉（贏潤生物有限公司），DMSO溶解劑（贏潤生物有限公司），MTT試劑盒（福州飛凈生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），DNA marker I（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），BMP-2 粉末包（2 μg）（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），0.25%胰酶+0.02%EDTA （美國Sigma公司），Trizol試劑（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），細(xì)胞蛋白裂解液（贏潤生物有限公司），抗體p38MAPK（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），抗體MEF2C（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），抗體CTnT（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），超凈工作臺(tái)（SWOJ-1F蘇凈集團(tuán)安泰公司），離心機(jī)（BiofugeStratos德國Thermo公司），恒溫水浴箱（SW2-261-79上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠），紫外分析儀（BOT-III北京中儀博騰科技有限公司），電泳儀 （DYY-8C北京六一儀器廠），VDS凝膠成像系統(tǒng) （GIAS-4400北京炳洋科技有限公司），顯微鏡（IX71日本 Olympus公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 含藥血清制備 將大鼠隨機(jī)分為柴胡三參膠囊組和空白對(duì)照組，每天于8：00和16：00分別灌服柴胡三參膠囊灌胃液及等量生理鹽水，采用連續(xù)7 d予3倍量給藥，依照體表面積3倍量進(jìn)行計(jì)算[11]（按成人70 kg、大鼠200 g體表面積換算：成人等效劑量4.8 g/d，折算為2.4 g/d，2次/d），于末次灌藥1 h后，注射水合氯醛使大鼠處于麻醉狀態(tài)，對(duì)大鼠下腹主動(dòng)脈取血，取血時(shí)隨即注入真空采血管，常溫下靜置2 h，待上清液析出，以3000 r/min離心10 min，再用移液槍小心析出上清，即為柴胡三參膠囊含藥血清，再將每組血清調(diào)勻后，放入56℃的水浴箱中滅活30 min，以0.22 μm的微孔濾膜過濾細(xì)菌，放于-20℃冰箱中保存以待取用，空白組同上操作分離出不含藥的空白血清。

1.4.2 常規(guī)細(xì)胞復(fù)蘇、換液、傳代、凍存 取出冷凍管，投入37℃水浴中，搖動(dòng)凍存管，使其融化；5 min內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積至少10倍；1000 r/min離心5 min；去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細(xì)胞；常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d后，去舊培養(yǎng)液，用無鈣、鎂的D-Hanks洗滌2次，添入培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；開啟培養(yǎng)房及工作臺(tái)，紫外消毒20 min，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，加入2 mL消化液，覆蓋整個(gè)細(xì)胞界面后吸棄，觀察培養(yǎng)瓶底端出現(xiàn)一層云霧狀，輕敲底部有塊狀物脫落，鏡下可見細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞回縮變圓，少量漂浮后加入10 mL含血清培養(yǎng)基終止消化，吹打管吹打數(shù)次將細(xì)胞懸液吸至離心管，1000 r/min離心5 min吸棄上清，加入PBS吹打混勻，1000 r/min再次離心5 min，丟棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基，吹打混勻，按比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶。當(dāng)細(xì)胞融合約80%～90%時(shí)，吸除培養(yǎng)基，用無菌D-Hanks液清洗2次，用含有0.02%EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，消化后吸除胰酶，加入約2 mL培養(yǎng)基吹打混勻細(xì)胞，轉(zhuǎn)入到15 mL離心管中，1000 r/min離心5 min，去除上清收集細(xì)胞，用凍存液（10%DMSO、90%FBS）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1 mL，標(biāo)記細(xì)胞種類、凍存日期、細(xì)胞傳代數(shù)，采用梯度降溫方法進(jìn)行細(xì)胞凍存：用脫脂棉包裹凍存管，4℃放置 15～30 min，-20 ℃約 1～2 h，-80 ℃保存12 h，最后存入液氮罐中備用。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 MTT法檢測BMSCs增殖 按柴胡三參膠囊含藥血清占培養(yǎng)液的比例分為0%、5%、10%、20%、40%5個(gè)濃度組，每組建立6個(gè)復(fù)孔，應(yīng)時(shí)添加一定MTT溶液及DMSO溶解液，490 nm波長下獲取OD值，確定最佳濃度后，分6、12、24、48 h 4個(gè)時(shí)段進(jìn)行觀察，得到最佳時(shí)間。

1.5.2 Western blotting法檢測各組細(xì)胞內(nèi)p38MAPK mRNA表達(dá) 分為空白組、BMP-2+柴胡三參組、BMP-2組、柴胡三參組。以6孔板收集細(xì)胞，胰酶消化，按比例加入RIPA和PMSF，冰凍且分裂細(xì)胞30 min后，離心5 min，將上清在-20℃條件下分裝凍存。選取0、1、2、4、8、12、16、20 μL 8 個(gè)容量將標(biāo)準(zhǔn)液注入 96 孔板的前面8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔中，再在其他的板孔中鋪入10 μL待測樣品，陸續(xù)加入PBS，常溫下靜置30 min。測定蛋白濃度至A560，得出蛋白濃度。按照前期比例調(diào)配濃縮膠，使其高度融合。算出體積，根據(jù)buffer=4∶1的標(biāo)準(zhǔn)均勻混入上樣buffer，逐步加入Marker和待分析樣品，分別以80 V及100 V恒壓進(jìn)行電泳，量出目的蛋白的長與寬，過濾10 s，置入有10%甲醇的器皿，注入去離子水及電轉(zhuǎn)液。以恒流20 mA轉(zhuǎn)膜，PBS液清洗后置于搖床，完成后于靜置90 min。用相應(yīng)抗體加入一抗稀釋液，室溫下?lián)u床孵育90 min，以PBS洗滌3次，每次10 min，同上行二抗孵育。標(biāo)準(zhǔn)化將ECL工作液鋪滿膜層表面，安放1～2 min后在凝膠成像系統(tǒng)中查看以及攝像。

1.5.3 RT-PCR法檢測各組細(xì)胞內(nèi)MEF2C、CTnT蛋白表達(dá) 用胰酶液消化6孔板的細(xì)胞收集于EP管中，后以勻漿器勻漿，室溫放置5min并常規(guī)離心15 min。將離心后的均勻液體分層，上層液移至潔凈的試管中，接著注入無雜質(zhì)水連續(xù)吹打后存放于-80℃環(huán)境下。取少量RNA溶液用TE稀釋后，讀取標(biāo)準(zhǔn)的吸收值，A260下讀值為1表示RNA為40 μg/mL。輕彈管底將溶液混合，短暫離心。以70℃干浴3 min，取出靜置待其冷卻，再注入逆轉(zhuǎn)錄酶液0.5 μL，分別以35℃水浴60 min及90℃干浴3 min，用移液槍吸除cDNA（逆轉(zhuǎn)錄終溶液）溶液，存放于-80℃以備用。把樣品中待檢測基因予以即時(shí)定量PCR，將全數(shù)cDNA樣品調(diào)配即時(shí)定量PCR反應(yīng)體系。輕彈管底將溶液混合，6000 r/min短暫離心。把已調(diào)配的PCR反應(yīng)液體置于RT-PCR儀上啟動(dòng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：在93℃條件下預(yù)變性2 min，再以93℃ 1 min，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。將目的基因條帶p38MAPK mRNA、MEF2C、CTnT的蛋白與內(nèi)參照的平均吸光度值依次行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)和單因素方差分析。以P＜0.01為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)，分析各組產(chǎn)物相對(duì)量的情況。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測BMSCs生存率

見表1。經(jīng)柴胡三參膠囊含藥血清干預(yù)后，含藥血清濃度在培養(yǎng)液中所占比例為5%、10%、20%、40%時(shí)下各時(shí)間點(diǎn)OD值均較0%比例濃度下高 （P＜0.01），在20%濃度時(shí)達(dá)到最大值；以20%濃度在24 h時(shí)間節(jié)點(diǎn)下OD值均比其余各組高（P＜0.01），故考慮以20%干預(yù)24 h為最佳梯度。

表1 柴三膠囊對(duì)干細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 柴三膠囊對(duì)干細(xì)胞增殖的影響（±s）

與本濃度不同時(shí)間比較，*P＜0.05；與不同濃度同時(shí)間比較，△P＜0.05

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2.2 含藥血清誘導(dǎo)后BMSCs增殖情況

見圖1、2。鏡下可見大量密集的BMSCs懸浮或沉積于培養(yǎng)皿底，PBS緩沖液反復(fù)沖洗后可見少量散在分布的貼壁細(xì)胞，呈多角短梭形，胞核漿分界清晰，胞核位于胞體膨大部的中央，單核仁居多，胞體可有不規(guī)則突起可見多邊形，無異常突起突出；干預(yù)48 h后，反見細(xì)胞數(shù)量較24 h干預(yù)時(shí)減少，細(xì)胞密度降低，呈現(xiàn)不同程度的凋亡趨勢(shì)。

圖1 24hBMSCs增殖情況（40倍）

圖2 48hBMSCs增殖情況（40倍）

2.3 各組干預(yù)后BMSCs中p38MAPK mRNA表達(dá)

見表2，圖3。誘導(dǎo)后BMP-2組、BMP-2+柴胡三參組、柴胡三參組p38MAPK表達(dá)程度均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；BMP-2+柴胡三參組表達(dá)水平高于 BMP-2 組、柴胡三參組（P＜0.05）；BMP-2組與柴胡三參組對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。誘導(dǎo)后30 min，BMP-2+柴胡三參組內(nèi)的p38MAPK明顯可見，BMP-2組、柴胡三參組及空白組表達(dá)相對(duì)較弱。

表2 各組干細(xì)胞p38MAPK mRNA表達(dá)的影響（±s）

表2 各組干細(xì)胞p38MAPK mRNA表達(dá)的影響（±s）

與 BMP-2+柴胡三參組比較，*P＜0.05；與空白組比較，△P＜0.01。下同

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圖3 各組p38MAPK電泳條帶

2.4 各組干預(yù)后心肌基因指標(biāo)MEF2C、CTnT蛋白的表達(dá)

見表3。誘導(dǎo)后BMP-2組、BMP-2+柴胡三參組、柴胡三參組MEF2C表達(dá)水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；BMP-2+柴胡三參組表達(dá)水平高于 BMP-2 組、柴胡三參組（P＜0.05）；BMP-2組與柴胡三參組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組誘導(dǎo)后MEF2C、CTnT蛋白表達(dá)水平（±s）

表3 各組誘導(dǎo)后MEF2C、CTnT蛋白表達(dá)水平（±s）

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3 討 論

在BMSCs向心肌細(xì)胞分化過程中，有諸多的信號(hào)通路發(fā)揮作用，其中之一便是p38MAPK通路。它參與多類生物細(xì)胞過程的調(diào)控，尤其在干細(xì)胞的增生繁殖與分化的調(diào)控過程中具有舉足輕重的作用[12]。p38MAPK信號(hào)通路在由BMP-2介導(dǎo)的心肌細(xì)胞發(fā)育或分化的過程中具有關(guān)鍵作用，活化的p38MAPK能夠上調(diào)ATF2、MEF2C等多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而這兩種轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到許多基因啟動(dòng)子區(qū)AP-1位點(diǎn)，增加其轉(zhuǎn)錄活性，影響細(xì)胞的增殖、分化，以激活下游基因或蛋白如CTnT、MEF2C等的表達(dá)，達(dá)到向心肌細(xì)胞分化的目的[13]。

缺血性心律失常是由于心肌缺血引起心肌細(xì)胞壞死抑或凋亡，無法達(dá)到心肌修復(fù)要求進(jìn)而出現(xiàn)數(shù)量減少，導(dǎo)致電活動(dòng)形成及傳導(dǎo)均反常。缺血引發(fā)心臟中擁有正常舒縮效應(yīng)的心肌細(xì)胞數(shù)目下降，心功能減退。以往的觀念表明心臟不具有再生以及自我修復(fù)的功能，也無法進(jìn)行自我更新，只能依靠纖維瘢痕組織修復(fù)或未受損心肌細(xì)胞肥大來進(jìn)行代償[14]。目前，干細(xì)胞移植治療缺血性心律失常已成為研究的熱點(diǎn)。而BMSCs容易取材，對(duì)人體損害甚微，而且可以進(jìn)行定向分化，并且方便著床，缺血條件對(duì)其無明顯影響，自身細(xì)胞移植也未見明顯排異現(xiàn)象等。以上特性使BMSCs移植具有天然優(yōu)勢(shì)，成為干細(xì)胞移植主要的種子細(xì)胞[15-16]。本研究顯示，柴胡三參膠囊含藥血清作用后，BMSCs大量增殖且在24 h達(dá)到最大值，與誘導(dǎo)劑合用后細(xì)胞內(nèi)的p38MAPK、MEF2C及CTnT表達(dá)明顯升高，可見柴胡三參膠囊能夠促進(jìn)誘導(dǎo)劑與其受體相結(jié)合，促進(jìn)BMSCs向心肌細(xì)胞的分化。因此，在干細(xì)胞移植治療前以柴胡三參膠囊對(duì)誘導(dǎo)因素進(jìn)行預(yù)處理，能夠明顯增強(qiáng)BMSCs的分化能力，提高心肌修復(fù)效率。更加細(xì)致的研究P38MAPK信號(hào)通路在BMSCs分化中的作用，對(duì)于揭示BMSCs分化的機(jī)制及為臨床采用干細(xì)胞移植治療缺血性心律失常尋找更加高效的方法具有重要價(jià)值。