槐米多糖提取方法比較

吳昌術(shù)，朱廣雙

（蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，安徽蕪湖241000）

0 引言

多糖是一種由單糖通過糖苷鍵聚合而形成大分子聚合物，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、抑制腫瘤、降血糖、降血脂、抗凝血、抗血栓，抗氧化、抗衰老、抗疲勞、抗輻射、抗菌、消炎、抗病毒等生物活性[1-4]?；泵诪槎箍浦参锘钡幕ɡ伲犊?、性微寒，是一種藥食兩用植物。近代醫(yī)藥研究證實(shí)，槐米多糖具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、降血糖、抗凝血等藥理作用[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，植物多糖提取方法有多種，但對槐米多糖提取方法研究不多，已報(bào)道的有熱水提取法和超聲波輔助提取法等，未見酶法提取、超聲復(fù)合酶法提取報(bào)道，且這些方法之間缺乏比較。試驗(yàn)以槐米為原料，分別采用纖維素酶法、果膠酶法、復(fù)合酶法和超聲復(fù)合酶法提取槐米多糖，以槐米多糖提取率為評價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取條件，并比較各種提取方法，為槐米多糖開發(fā)應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：槐米，購于蕪湖市張恒春中藥房。

試劑：纖維素酶（10×104U/g），山東隆科特酶制劑有限公司提供；果膠酶（10×104U/g），青島益生堂生物有限公司提供；苯酚、無水乙醇、乙醚、石油醚、丙酮、醋酸、醋酸鈉、葡萄糖、濃硫酸，均為分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；722型分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器有限公司產(chǎn)品；FA11041V型電子分析天平，上海精密儀器有限公司產(chǎn)品；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；KQ3200DE型超聲波清洗器，昆山市超聲波儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料處理

在60℃條件下烘干槐米1 h左右，然后粉碎60目過篩。稱取處理后槐米粉200 g，用石油醚回流2次以上，以除去脂類，抽濾，藥渣風(fēng)干，再用80%乙醇回流提取2次，以除去單糖和低聚糖，抽濾，將藥渣烘干備用[5，7]。

1.3.2 酶法提取

準(zhǔn)確稱取上述經(jīng)脫脂烘干后藥渣5 g，料液比1∶30（g∶mL），加入150 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液，加酶保溫一定時(shí)間，升溫至100℃滅酶活10 min，抽濾濃縮，加無水乙醇使醇體積分?jǐn)?shù)為75%，醇沉過夜，以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心10 min后得沉淀物，沉淀物依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌數(shù)次后真空干燥，制得槐米粗多糖。將槐米粗多糖用蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，測定糖含量，計(jì)算多糖提取率。

1.3.3 超聲復(fù)合酶法提取

準(zhǔn)確稱取經(jīng)脫脂烘干后藥渣5 g，參考文獻(xiàn)[8]料液比1∶30（g∶mL），加入150 mL醋酸-醋酸鈉緩沖液，加酶保溫一定時(shí)間，升溫至100℃滅酶活10 min，冷卻，超聲提取一定時(shí)間，冷卻，按1.3.2從“抽濾”起操作，得到槐米粗多糖。將槐米粗多糖用蒸餾水溶解，定容至100 mL容量瓶中，測定糖含量，計(jì)算多糖提取率。

1.3.4 槐米多糖含量測定及得率的計(jì)算

槐米多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[9]。精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量葡萄糖100 mg，用蒸餾水溶解并定容于1 000 mL容量瓶中，即得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL分別置于10 mL具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)至2 mL。每只試管中分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置10 min，置恒溫水浴鍋中沸水加熱15 min，取出用流動(dòng)水冷卻至室溫，用分光光度計(jì)于波長490 nm處測其吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL） 為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=5.936X+0.012 6，R=0.999 2，線性范圍為0.01～0.08 mg/mL。

將上述酶法提取、超聲酶法提取粗多糖分別用蒸餾水溶解定容至100 mL容量瓶中，然后用移液管精密吸取樣品液1 mL置于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水1 mL，按上述從“分別加入5%苯酚溶液1.0 mL”起操作，于波長490 nm處測定吸光度，每份樣品做3次平行試驗(yàn)，取平均值。

槐米多糖得率計(jì)算公式：

式中：C——測定樣液中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——樣液總體積，mL；

M——提取所用槐米干粉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶法提取槐米多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

以加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值為影響因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，按照1.3.2所述工藝流程用纖維素酶法提取槐米多糖，確定各因素對槐米多糖提取率影響，優(yōu)化提取工藝條件[10-13]。

纖維素酶法正交試驗(yàn)及結(jié)果見表1。

表1 纖維素酶法正交試驗(yàn)及結(jié)果

從表1極差大小結(jié)果可知，影響槐米多糖提取率的因素主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，即加酶量＞酶解pH值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度，較優(yōu)組合是A2B3C2D3，最佳提取條件為纖維素酶加酶量1%，酶解溫度65℃，酶解時(shí)間60 min，酶解pH值6。采用最佳提取條件提取槐米多糖，多糖提取率為6.10%。

2.2 果膠酶法提取槐米多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

以加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值為影響因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，按照1.3.2中所述工藝流程用果膠酶法提取槐米多糖，確定各因素對槐米多糖提取率影響，優(yōu)化提取工藝條件[11-13]。

果膠酶法正交試驗(yàn)及結(jié)果見表2。

從表2極差大小結(jié)果可知，影響槐米多糖提取率的因素主次順序?yàn)锳＞D＞C＞B，即加酶量＞酶解pH值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度，較優(yōu)組合是A2B2C2D3，最佳提取條件為果膠酶加酶量1.0%，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間60 min，酶解pH值6。采用最佳提取條件提取槐米多糖，多糖提取率為6.29%。

2.3 復(fù)合酶法提取槐米多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1～表2可知，影響槐米多糖提取率的因素主次順序均為加酶量＞酶解pH值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度。對試驗(yàn)結(jié)果影響較大是加酶量和酶解pH值，而影響最小是酶解溫度，即在45～65℃溫度范圍內(nèi)對試驗(yàn)結(jié)果影響較小，因此酶解溫度固定為55℃，以纖維素酶、果膠酶的加酶量、酶解時(shí)間、酶解pH值為影響因素，每因素設(shè)3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，按照1.3.2中所述工藝流程，采用復(fù)合酶法提取槐米多糖，確定各因素對槐米多糖提取率影響，優(yōu)化提取工藝條件。

表2 果膠酶法正交試驗(yàn)及結(jié)果

復(fù)合酶法正交試驗(yàn)及結(jié)果見表3。

表3 復(fù)合酶法正交試驗(yàn)及結(jié)果

從表3極差大小結(jié)果可知，影響槐米多糖提取率的因素主次順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即果膠酶量＞纖維素酶量＞酶解pH值＞酶解時(shí)間，較優(yōu)組合是A1B2C3D3，最佳提取條件為纖維素酶加酶量0.5%，果膠酶量1.0%，酶解時(shí)間80 min，酶解pH值6。采用最佳提取條件提取槐米多糖，多糖提取率為6.54%。

2.4 超聲波復(fù)合酶法提取槐米多糖正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.1～2.3的試驗(yàn)結(jié)果，固定纖維素酶加量0.5%，果膠酶加量1%，酶解溫度55℃，酶解pH值6，以料液比、酶解時(shí)間、超聲功率、超聲時(shí)間為影響因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，按照1.3.3中所述超聲波復(fù)合酶提取的工藝流程提取槐米多糖，確定各因素對槐米多糖提取率影響，優(yōu)化提取工藝條件。

超聲波復(fù)合酶法正交試驗(yàn)及結(jié)果見表4。

表4 超聲波復(fù)合酶法正交試驗(yàn)及結(jié)果

從表4極差大小結(jié)果可知，影響槐米多糖提取率的因素主次順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即酶解時(shí)間＞超聲時(shí)間＞料液比＞超聲功率，較優(yōu)組合是A2B3C3D3，最佳提取條件為料液比1∶30，酶解時(shí)間80 min，超聲時(shí)間40 min，超聲功率400 W。采用最佳提取條件提取槐米多糖，多糖提取率為7.42%。

2.5 多糖提取方法比較

根據(jù)2.1～2.4試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合參考文獻(xiàn)[5]，比較6種槐米多糖提取方法的最佳提取條件和多糖提取率。

提取方法比較見表5。

表5 提取方法比較

從表5結(jié)果可知，熱水提取法時(shí)間最長，超聲波提取法時(shí)間最短，2種方法多糖提取率均偏低且無明顯差異。2種單一酶法多糖提取率均高于熱水提取法和超聲波法，以果膠酶法最高。復(fù)合酶法提取率稍高于果膠酶法，說明2種酶共同作用并未顯著提高多糖提取率。超聲復(fù)合酶法多糖提取率顯著提高，說明超聲復(fù)合酶法對多糖提取有較大促進(jìn)作用。

多糖化合物存在于植物細(xì)胞壁中，因此用復(fù)合酶處理槐米樣品，纖維素酶和果膠酶可破壞細(xì)胞壁，復(fù)合酶聯(lián)合作用有利于多糖溶出，再結(jié)合超聲波處理，利用超聲的空化作用而使多糖溶出大為增加，因此超聲復(fù)合酶法是一種高效多糖提取方法。

3 結(jié)論

采用纖維素酶法、果膠酶法、復(fù)合酶法、超聲復(fù)合酶法等方法分別提取槐米多糖，以提取率為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化了提取條件，對各種提取方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，與熱水提取法和超聲波法相比，纖維素酶法、果膠酶法均能提高槐米多糖提取率，時(shí)間也大為縮短，其中超聲波與復(fù)合酶協(xié)同作用能顯著提高槐米多糖提取率。在最佳提取條件下，槐米多糖提取率分別為纖維素酶法6.10%，果膠酶法6.29%，復(fù)合酶法6.54%，超聲復(fù)合酶法7.42%。