雙抗體夾心ELISA法測(cè)定食物中蝦過(guò)敏原成分

□ 李曉燕 張樹(shù)華 侯國(guó)強(qiáng) 張春濤 濰坊工商職業(yè)學(xué)院

近年來(lái)，食物過(guò)敏癥受到人們的關(guān)注，尤其是蝦等甲殼類(lèi)動(dòng)物以及其制品均會(huì)引起食物過(guò)敏的現(xiàn)象，其過(guò)敏表現(xiàn)主要為蕁麻疹、風(fēng)疹、哮喘等，嚴(yán)重的甚至?xí)?duì)生命安全造成威脅。本文探究如何利用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)蝦過(guò)敏原成分。

1 材料和方法

1.1 材料

本次實(shí)驗(yàn)中選取了來(lái)自某動(dòng)物學(xué)院中心的4周齡小鼠和30例2017年2月至2018年2月到某醫(yī)院就診的塵螨皮試呈陽(yáng)性的患者。收集患者血清進(jìn)行，制備血清池，購(gòu)買(mǎi)新鮮的蝦。

1.2 方法

在制備與純化蝦過(guò)敏原多克隆抗體的過(guò)程中，先首次免疫，取經(jīng)過(guò)純化的抗原蛋白10 μg和等量的弗氏完全佐劑，混合乳化后，皮下注射到小鼠的頸部和背部。第2次加強(qiáng)免疫時(shí)，取與之前等量的抗原蛋白，再加入等量的不完全佐劑，免疫之間要相隔3周，第3次免疫后的第5 d，采集血，并進(jìn)行離心后將血清分離出，進(jìn)行抗血清純化。將純化好的抗體的原緩沖液用PBS進(jìn)行替換，然后按照一定的比例將抗體和生物素混合，放置在避光處，一段時(shí)間后，按照說(shuō)明書(shū)回收膜柱。

蝦過(guò)敏原多克隆抗體制備完成后，利用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定蝦過(guò)敏原，先采用吸附法包被蝦過(guò)敏原多克隆抗體，在每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL包被緩沖液，放置在4 ℃的環(huán)境下過(guò)夜后將包被液倒掉，再采用同樣的方法加入200 μL的封閉液，擱置在37 ℃下振蕩2 h，將封閉液倒掉。在粗蝦提取時(shí)，要按照比例稀釋?zhuān)總€(gè)孔內(nèi)加入100 μL后，與PBS進(jìn)行陰性對(duì)照。在37 ℃下振蕩1 h，然后用PBST清洗3遍。在對(duì)生物素標(biāo)記的抗蝦過(guò)敏原多克隆抗體稀釋時(shí)，按照1∶500的比例在每個(gè)孔內(nèi)加入100 μL的稀釋液，在37 ℃下振蕩1 h，然后用PBST清洗3遍。以1∶500的比例將HRB-鏈酶親和素進(jìn)行稀釋?zhuān)诿總€(gè)孔內(nèi)加入100 μL的稀釋液，在37 ℃下振蕩1 h，然后用PBST清洗3遍。將底物液加入，在37 ℃的環(huán)境下振蕩10 min，讀數(shù)并做好記錄[1]。

2 測(cè)定結(jié)果

2.1 鑒定抗蝦過(guò)敏原的抗體

蝦過(guò)敏原抗體能夠?qū)?1、36、23、19等組分進(jìn)行識(shí)別，因此，可判定此抗體能夠?qū)ξr主要過(guò)敏原蛋白的組分36 Ku進(jìn)行識(shí)別。

2.2 對(duì)間接ELISA檢測(cè)鼠蝦過(guò)敏原蛋白多克隆抗體的IgG效價(jià)

鼠蝦過(guò)敏原蛋白多克隆抗體的IgG效價(jià)的滴度曲線，如圖1所示。

圖1 鼠蝦過(guò)敏原蛋白多克隆抗體的IgG效價(jià)的滴度曲線

圖2 雙抗體夾心ELISA法測(cè)定食物中蝦過(guò)敏原成分的曲線

由圖1可知，陰性組抗體的滴度隨著吸光度的增加而下降，將陽(yáng)性孔與陰性孔的比值大于2.1定位測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，此時(shí)測(cè)得免疫血清的效價(jià)為1:204 800。

2.3 雙抗體夾心ELISA法測(cè)定蝦成分過(guò)敏原成分的曲線

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的蝦總蛋白提取液進(jìn)行稀釋?zhuān)瑴y(cè)定雙抗體夾心ELISA法的檢出限（如圖2所示）。吸光值隨著抗原濃度的降低而下降，以測(cè)定孔與陰性孔比值大于2.1為標(biāo)準(zhǔn)，得出蝦蛋白的檢出最低限為40 ng/mL，并且標(biāo)準(zhǔn)曲線在40～1 000 ng/mL之間的線性良好。

3 討論

相關(guān)研究顯示即使是不同品種的蝦產(chǎn)品，其過(guò)敏原實(shí)際上并沒(méi)有變化。而通過(guò)本次研究，可以發(fā)現(xiàn)雙抗體夾心ELISA法測(cè)定食物中蝦過(guò)敏原成分具有較好的靈敏度和特異性，相比其他方法減少了抗體的用量。

本次研究沒(méi)有完全測(cè)定出食品中蝦過(guò)敏原含量，這可能是由于區(qū)域之間存在著較大的差異，但是為我國(guó)食品安全過(guò)敏原檢測(cè)問(wèn)題提供了技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，為更好地管理食品過(guò)敏原打好了基礎(chǔ)。