淺談食品中微生物的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法

□ 陳 丹 付偉超 商丘市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)測(cè)試中心

“民以食為天，食以安為先”，隨著生活水平的不斷提升，人們對(duì)于食品的要求也比以前要嚴(yán)格得多，不僅限于以前的能夠吃飽飯，怎樣能夠吃好，吃得有營(yíng)養(yǎng)成為當(dāng)今生活的主方向。大家的目光逐漸關(guān)注到食品這方面。隨著我國(guó)食品生產(chǎn)，加工過(guò)程和流通過(guò)程的快速發(fā)展，導(dǎo)致不少黑心商販開(kāi)始投機(jī)取巧，毒豆芽、紅心鴨蛋、“大頭娃娃事件”、皮革酸奶等等漸漸出現(xiàn)在大家的生活中。食品安全問(wèn)題成為大家關(guān)注的重大問(wèn)題。

隨著食品發(fā)展速度的加快，不僅僅國(guó)內(nèi)食品的流通，不少進(jìn)口食品深受當(dāng)今國(guó)民的喜愛(ài)，很多人開(kāi)始喜歡海外代購(gòu)。由于微生物中的致病性細(xì)菌可以導(dǎo)致的疾病不斷增加，而且食品中的致病性細(xì)菌會(huì)危害人們的健康，在國(guó)外公布的那些微生物污染食品和人類健康的事件在我國(guó)依然存在。

食品是否發(fā)霉變質(zhì)直接影響到消費(fèi)者的身體健康，故食品中菌落總數(shù)、霉菌、致病菌的測(cè)定是評(píng)判產(chǎn)品質(zhì)量是否合格、是否對(duì)人類的健康產(chǎn)生危害的重要指標(biāo)。本文對(duì)食品中經(jīng)常檢測(cè)的幾項(xiàng)微生物指標(biāo)的檢測(cè)方法進(jìn)行探討。

1 食品中菌落總數(shù)的常規(guī)檢測(cè)方法

菌落總數(shù)的檢測(cè)是食品微生物檢測(cè)中最常規(guī)的檢測(cè)。食品中菌落總數(shù)的多少直接影響食品的貨架期，控制好菌落總數(shù)的數(shù)值在食品品質(zhì)方面有著重要的作用。當(dāng)今，菌落總數(shù)的檢測(cè)方法常規(guī)有兩種，一種是參照GB4789.2-2016的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，另一種是紙片快速檢測(cè)方法。

1.1 菌落總數(shù)的定義

菌落總數(shù)是指食品檢驗(yàn)樣品按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的處理辦法，在一定溫度下，使用一定的培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定的時(shí)間后，所得每克樣品或者是每毫升樣品中生長(zhǎng)出來(lái)的微生物的總稱。該項(xiàng)目主要作為判定食品被細(xì)菌污染程度的標(biāo)記，也可應(yīng)用菌落總數(shù)的檢驗(yàn)方法來(lái)反映食品在生長(zhǎng)儲(chǔ)存的狀態(tài)中微生物繁殖的情況、生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)。以反映食品在生產(chǎn)、加工、銷售過(guò)程中是否符合衛(wèi)生要求，為被檢驗(yàn)樣品是否合格，人們是否可以使用提供一定的參考。

1.2 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素：無(wú)菌意識(shí)

在進(jìn)行食品微生物的各項(xiàng)檢測(cè)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)者必須明確一個(gè)非常關(guān)鍵的因素——無(wú)菌意識(shí)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)使用的所有東西都必須是無(wú)菌的、經(jīng)過(guò)殺毒滅菌的。實(shí)驗(yàn)環(huán)境所謂的無(wú)菌，是指在環(huán)境中一切有生命活動(dòng)的微生物的細(xì)胞及其孢子或芽胞都不存在。對(duì)實(shí)驗(yàn)人員來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)用的實(shí)驗(yàn)服、帽子、口罩、全部都是殺過(guò)菌的，實(shí)驗(yàn)人員的手部要進(jìn)行消毒。實(shí)驗(yàn)使用的所有材料和物品包括培養(yǎng)皿、鑷子、剪刀、培養(yǎng)基等都是經(jīng)過(guò)高壓滅菌后的。無(wú)菌意識(shí)在整個(gè)過(guò)程都要嚴(yán)格遵守。

圖1 菌落總數(shù)操作過(guò)程

1.3 實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程

微生物的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，按照GB4789.2-2016的操作過(guò)程進(jìn)行操作。按圖1中的過(guò)程進(jìn)行操作。對(duì)待做樣品要進(jìn)行連續(xù)倍數(shù)的樣品稀釋。制備10倍系列稀釋的樣品勻液時(shí)，每一步都應(yīng)該搖勻試管或反復(fù)吹吸，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以使用滅菌后的移液管或者可以滅菌的槍頭的移液器，使待測(cè)樣品中的菌體能夠充分分散均勻。

對(duì)于一些酸度較高的樣品，例如食醋，需要按標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.22-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 調(diào)味品檢驗(yàn)》中的要求先用滅菌的20%～30%碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)至中性后才可以準(zhǔn)確檢測(cè)出菌落總數(shù)。不然食品的酸度太高將影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，最終的結(jié)果有可能直接是0。 pH值的大小一定會(huì)影響食品中菌落總數(shù)的測(cè)定結(jié)果，只有做實(shí)驗(yàn)時(shí)將pH值調(diào)至中性，才能準(zhǔn)確測(cè)定出食品中的菌落總數(shù)。通過(guò)不少實(shí)驗(yàn)證明，pH值在3.8～7.0時(shí)，對(duì)菌落總數(shù)檢驗(yàn)的結(jié)果會(huì)影響小一些，隨著pH值的減小，菌落總數(shù)就會(huì)越來(lái)越小。當(dāng)所檢測(cè)的pH值結(jié)果在2.1前后時(shí)，可以對(duì)瓊脂上的菌落總數(shù)起到完全抑制作用。因此，大家在實(shí)驗(yàn)中一定要仔細(xì)認(rèn)真，考慮pH值對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響，做實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要先調(diào)節(jié)pH值至中性后，才能檢驗(yàn)出菌落總數(shù)的真實(shí)結(jié)果。

1.4 樣品從稀釋到傾注平板的時(shí)間要求

在一般的實(shí)驗(yàn)室中，由于每次進(jìn)行檢驗(yàn)的樣品數(shù)量比較多，實(shí)驗(yàn)室工作人員為了可以保證工作效率，保證操作的連續(xù)和方便性，實(shí)驗(yàn)人員一般都是先將所有待檢樣品稀釋好后，再依次傾注平板，如此操作就導(dǎo)致一個(gè)樣品由開(kāi)始稀釋到傾注平板的總時(shí)間通常要一個(gè)小時(shí)以上。經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)的樣品樣從稀釋到傾注平板的時(shí)間間隔越長(zhǎng)，測(cè)出來(lái)的結(jié)果會(huì)越多。菌落總數(shù)的生長(zhǎng)速度跟時(shí)間呈正比增長(zhǎng)的關(guān)系，短短的十幾分鐘對(duì)于呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)菌來(lái)說(shuō)有可能已經(jīng)生了很多代。因此，樣品從處理稀釋樣品開(kāi)始到傾注平板的時(shí)間最好不要超過(guò)20 min。

1.5 培養(yǎng)基溫度要求

樣品稀釋后，做出合理的稀釋倍數(shù)后，接著進(jìn)行倒平板。倒平板所用的培養(yǎng)基都是滅菌后冷卻至46 ℃左右的培養(yǎng)基。倒平板所使用的培養(yǎng)基溫度過(guò)高可能會(huì)殺滅部分不耐熱的細(xì)菌，也會(huì)使冷凝水過(guò)多，滴落在培養(yǎng)基表面，使生長(zhǎng)在平板底部的細(xì)菌蔓延生長(zhǎng)，影響菌落總數(shù)的計(jì)數(shù)。培養(yǎng)基的溫度太低時(shí)，瓊脂容易凝固，使得培養(yǎng)基無(wú)法與稀釋液充分混勻，菌落無(wú)法均勻生長(zhǎng)，也會(huì)影響菌落計(jì)數(shù)。倒好培養(yǎng)基后，沿一個(gè)方向進(jìn)行搖晃直到稀釋樣品與培養(yǎng)基混合均勻。將平板倒置存放于36 ℃的培養(yǎng)箱中48 h。

2 食品中霉菌計(jì)數(shù)的常規(guī)檢測(cè)方法

霉菌是絲狀真菌的通稱。霉菌廣泛存在于自然界中，因?yàn)槊咕鷷?huì)形成各種各樣微小的孢子，孢子通過(guò)各種傳播途徑很容易污染食品。當(dāng)溫度和濕度適合霉菌生長(zhǎng)時(shí)，會(huì)非常迅速地形成分枝繁茂的菌絲體，但又不像蘑菇那樣產(chǎn)生大型的子實(shí)體。在潮濕溫暖的地方，很多物品上長(zhǎng)出一些肉眼可見(jiàn)的絨毛狀、絮狀或蛛網(wǎng)狀的菌落，那就是霉菌。溫度對(duì)霉菌的繁殖及產(chǎn)毒均有重要的影響，不同種類的霉菌其最適溫度是不一樣的，很多霉菌繁殖最適宜的溫度為24～30 ℃。由于霉菌的生長(zhǎng)繁殖周期短，生長(zhǎng)極為迅速，非常容易造成食品的發(fā)霉腐爛，最后變質(zhì)。發(fā)霉的花生、發(fā)霉的玉米和小麥中的黃曲霉毒素非常高，人類誤食了發(fā)霉的食品會(huì)引起身體的癌變。自從20世紀(jì)六七十年代發(fā)現(xiàn)強(qiáng)致癌的黃曲霉毒素以來(lái)，霉菌與霉菌毒素對(duì)食品的污染引起了人們的重視。我國(guó)制定了 GB2761-2017《食品中真菌毒素限量》標(biāo)準(zhǔn) 、GB4789.15-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》，各個(gè)食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)都全面開(kāi)展霉菌的檢測(cè)工作。

2.1 霉菌的培養(yǎng)方式

有關(guān)霉菌的檢驗(yàn)方法跟前面所述的菌落總數(shù)的檢測(cè)方法的注意事項(xiàng)相似。2017年4月19日，有關(guān)霉菌檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)改變了，GB4789.15-2016跟GB 4789.15-2010的最大改變就是5.2中的培養(yǎng)中平板的培養(yǎng)方式。2010版的標(biāo)準(zhǔn)中霉菌平板的是待瓊脂凝固后，將平板倒置，（28±1）℃培養(yǎng)5 d，觀察并記錄；2016版的標(biāo)準(zhǔn)中霉菌平板的是待瓊脂凝固后，正置平板，（28±1）℃培養(yǎng)5 d，觀察并記錄。通過(guò)半年來(lái)的實(shí)驗(yàn)證明，倒置平板的培養(yǎng)方式出來(lái)的結(jié)果比較準(zhǔn)確。正置平板培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)箱中的溫度不斷升高，致使底部的培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)，遇到培養(yǎng)皿的上部，水分會(huì)匯集在一起,集聚到一定的大小時(shí)，會(huì)滴落到下層的培養(yǎng)基上，造成下部霉菌數(shù)的不準(zhǔn)確。另有些霉菌會(huì)長(zhǎng)孢子，早期生長(zhǎng)出的霉菌孢子就會(huì)在培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散，形成新的菌落，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。所以，筆者認(rèn)為霉菌的培養(yǎng)方式還是應(yīng)該采用倒置培養(yǎng)，這樣結(jié)果更接近于產(chǎn)品的自身結(jié)果。

2.2 解決霉菌偏差的方法

對(duì)于每次實(shí)驗(yàn)中結(jié)果的偏差，實(shí)驗(yàn)室可以讓不同的實(shí)驗(yàn)人員按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)樣品應(yīng)選取均勻且霉菌數(shù)均可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的測(cè)試樣品。對(duì)于同一個(gè)樣品，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該做多次的平行實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定最終的霉菌數(shù)量。

2.3 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法霉菌檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，所以在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)人員有必要進(jìn)行多次觀察。實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)前做好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃，確定觀察記錄的時(shí)間。一般情況下在培養(yǎng) 24 h后就應(yīng)該進(jìn)行觀察，對(duì)于那些生長(zhǎng)迅速的，菌絲很長(zhǎng)的一類霉菌 48 h 后就可計(jì)數(shù)。 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)人員可以在操作工作臺(tái)上放置兩個(gè)倒好培養(yǎng)基的，待接種結(jié)束后，與同批次進(jìn)行的霉菌進(jìn)行一起培養(yǎng)，來(lái)對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行驗(yàn)證，可以發(fā)現(xiàn)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中是否受環(huán)境污染。檢驗(yàn)前后都應(yīng)認(rèn)真做好全面的消毒滅菌工作。霉菌計(jì)數(shù)結(jié)束后應(yīng)第一時(shí)間將有霉菌的培養(yǎng)物高壓滅菌,以防進(jìn)一步污染。

3 結(jié)語(yǔ)

微生物檢測(cè)的誤差除了培養(yǎng)基和檢測(cè)環(huán)境之外，還來(lái)自于實(shí)驗(yàn)樣品和檢驗(yàn)的操作過(guò)程和實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備環(huán)節(jié)。通常情況下食品微生物樣品的檢測(cè)不能復(fù)檢。但如果當(dāng)菌落總數(shù)在此樣品所執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)的臨界值或者菌落結(jié)果出現(xiàn)明顯的異常時(shí)，也是有必要進(jìn)行復(fù)檢的?？梢灾匦聶z測(cè)儲(chǔ)存條件跟之前相符的同一生產(chǎn)批次的樣品。食品微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性，必須貫穿在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。只有嚴(yán)格控制，才能控制好食品的安全性，才能保證國(guó)民的安全！