脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)和2 種保鮮劑在清蒸鯉魚(yú)中的應(yīng)用

蔣 奕，俞龍浩*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

鯉魚(yú)是最重要的商業(yè)淡水魚(yú)類之一[1]，其因富含蛋白質(zhì)及不飽和脂肪酸而頗受消費(fèi)者喜愛(ài)，但內(nèi)源性酶及微生物作用引起的脂質(zhì)氧化[2]使魚(yú)制品在貯藏過(guò)程中極易氧化變質(zhì)。基于目前傳統(tǒng)殺菌技術(shù)存在的種種不足，為了更好地延緩鯉魚(yú)制品的質(zhì)量惡化，冷殺菌技術(shù)逐漸成為研究熱點(diǎn)。

脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種非熱殺菌技術(shù)[3]，其利用瞬時(shí)、高強(qiáng)度的脈沖光能量對(duì)食品中各類微生物進(jìn)行快速滅菌[4-6]。因操作安全、殺菌均勻[7]等優(yōu)點(diǎn)，脈沖強(qiáng)光殺菌技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于畜禽產(chǎn)品、果蔬制品及糧油制品中[8]。何余堂等[9]研究脈沖強(qiáng)光技術(shù)對(duì)鮮食玉米的保鮮效果，結(jié)果表明，當(dāng)脈沖能量300 J、脈沖距離10 cm、閃照次數(shù)32 次時(shí)，玉米的保鮮效果最好。王勃等[10]的研究表明，當(dāng)閃照距離10 cm、脈沖能量400 J時(shí)，脈沖強(qiáng)光對(duì)月餅表面霉菌的殺菌率可達(dá)99.85%。

隨著人們健康安全意識(shí)的不斷提升，雙乙酸鈉作為高效、無(wú)毒的殺菌防腐劑越來(lái)越受到消費(fèi)者的好評(píng)。1987年，世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織批準(zhǔn)雙乙酸鈉作為防腐劑添加到食品中[11]。雙乙酸鈉具有性能好[12]、應(yīng)用范圍廣、使用方便靈活（可直接加入到食品中或浸漬、噴灑）[13]及營(yíng)養(yǎng)特殊等優(yōu)點(diǎn)[14]，被廣泛用于烘烤食品、肉制品、果蔬制品及飲料制品等加工食品中[15]。雙乙酸鈉對(duì)魚(yú)類有特殊的保鮮效果，將用10%雙乙酸鈉水溶液浸泡過(guò)的魚(yú)放入塑料袋內(nèi)，室溫（25 ℃）放置15 d仍然能夠保持新鮮[16]。

乳酸雙芽菌是一種新型的液態(tài)生物食品防腐劑[17]，由于其抑菌效果好、安全無(wú)副作用（在消化道內(nèi)降解為食品中所含的正常成分）、使用方便（可直接加入到食品中，也可經(jīng)噴霧干燥成粉后加入到食品中），目前已廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、飲料制品、烘焙食品及發(fā)酵食品等領(lǐng)域[18]。王心禮[19]的研究表明，乳酸雙芽菌對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果普遍優(yōu)于山梨酸鉀。侯靖等[20]發(fā)明的腐竹花生黃豆的專用防腐工藝專利表明，乳酸雙芽菌對(duì)其熟化的腐竹、花生、黃豆中的絕大多數(shù)菌有殺滅作用，5 d后霉菌發(fā)生概率在5%以下，且保質(zhì)期可達(dá)18 個(gè)月。

關(guān)于脈沖強(qiáng)光對(duì)食品殺菌的研究，國(guó)內(nèi)外從20世紀(jì)90年代初開(kāi)始就有相關(guān)報(bào)道[21]。而關(guān)于脈沖強(qiáng)光殺菌結(jié)合保鮮劑在清蒸鯉魚(yú)中的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外還尚未報(bào)道。本研究的目的為優(yōu)化脈沖強(qiáng)光殺菌結(jié)合雙乙酸鈉和乳酸雙芽菌2 種保鮮劑應(yīng)用于清蒸鯉魚(yú)保鮮時(shí)的最佳殺菌條件，旨在為后續(xù)的魚(yú)制品加工保鮮提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鯉魚(yú)購(gòu)自黑龍江省大慶市北京華聯(lián)超市，所有鯉魚(yú)均在同一水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖，質(zhì)量（1 138.5±71.0） g，長(zhǎng)度（39.8±1.0） cm。

雙乙酸鈉 南通奧凱生物科技開(kāi)發(fā)有限公司；乳酸雙芽菌 綏化市藍(lán)源生物工程有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司；氯化鈉 遼寧泉瑞試劑有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S24電熱恒溫水浴鍋、DGG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DRP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；DL-CJ-2NDI潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；MXA3*18EA1脈沖強(qiáng)光消毒柜 常州市蘭諾光電科技有限公司；AR223CN電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；ScienTZ-04無(wú)菌均質(zhì)機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將鯉魚(yú)進(jìn)行敲擊式擊暈，隨后宰殺并去腮、去鱗、去內(nèi)臟，20 min內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗鯉魚(yú)體表和體內(nèi)的血液，并將魚(yú)腹腔內(nèi)的所有黑膜去除。清洗后的鯉魚(yú)進(jìn)行均勻分塊，備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將魚(yú)肉塊分別浸入不同質(zhì)量濃度的雙乙酸鈉和乳酸雙芽菌中，浸泡0.5 h取出后清蒸（放入蔥、姜、鹽調(diào)味）；清蒸后冷卻至室溫，將肉塊裝入透明的聚乙烯包裝袋中熱封，隨即進(jìn)行脈沖強(qiáng)光殺菌處理。

按照不同條件對(duì)魚(yú)肉塊進(jìn)行處理，放置1 d后，測(cè)定其菌落總數(shù)，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)：1）不同雙乙酸鈉質(zhì)量濃度（0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 g/100 mL）、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.13 g/100 mL、脈沖能量400 J、脈沖距離10 cm；2）不同乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度（0.05、0.09、0.13、0.17、0.21 g/100 mL）、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度0.9 g/100 mL、脈沖能量400 J、脈沖距離10 cm；3）不同脈沖能量（200、300、400、500、600 J）、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度0.9 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.13 g/100 mL、脈沖距離10 cm；4）不同脈沖距離（6、8、10、12、14 cm）、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度0.9 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.13 g/100 mL、脈沖能量400 J。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以脈沖能量、脈沖距離、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度4 個(gè)因素為自變量，以魚(yú)肉的菌落總數(shù)為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.4 菌落總數(shù)測(cè)定

參考GB/T 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》[22]。稱取25 g魚(yú)肉糜，置于225 mL無(wú)菌生理鹽水中，在振蕩器上充分振蕩混勻，制成魚(yú)肉糜和魚(yú)漿液比例為1∶10（m/V）的樣品勻液；用1 mL無(wú)菌吸管吸取1 mL樣品勻液，沿管壁緩慢注于盛有9 mL生理鹽水的無(wú)菌試管中，制成1∶100（m/V）的樣品勻液；依此類推，選取3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（包括原液），各取1 mL稀釋液，于平板計(jì)數(shù)瓊脂平板上進(jìn)行涂布，（30±1） ℃培養(yǎng)（72±3） h，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落總數(shù)。菌落總數(shù)按照下式計(jì)算。

式中：ΣC為平板菌落數(shù)之和；n1為第1稀釋度（稀釋100 倍）平板個(gè)數(shù)；n2為第2稀釋度（稀釋1 000 倍）平板個(gè)數(shù)；d為稀釋因子（第1稀釋度）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用Origin 2017軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 雙乙酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響

圖1 雙乙酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響Fig. 1 Effect of sodium diacetate concentration on aerobic bacterial count of steamed carp

由圖1可知，隨著雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的增大，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)雙乙酸鈉質(zhì)量濃度分別為0.5、0.7、0.9 g/100 mL時(shí)，其對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響顯著（P＜0.05）；雙乙酸鈉的質(zhì)量濃度繼續(xù)增大為1.1、1.3 g/100 mL時(shí)，其對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與未用雙乙酸鈉處理的清蒸鯉魚(yú)相比，用雙乙酸鈉處理過(guò)的鯉魚(yú)菌落總數(shù)降低，其抗菌作用是由于其分子內(nèi)的單分子乙酸與類脂化合物能較好地相溶，因而能夠較有效地透過(guò)細(xì)胞壁，滲透進(jìn)入霉菌或細(xì)菌的細(xì)胞體中，干擾細(xì)胞間酶的相互作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性，使菌體細(xì)胞脫水死亡，從而起到抑菌作用[23]。殷銘等[24]的研究表明，用20%雙乙酸鈉水溶液對(duì)萵苣、草莓等果蔬進(jìn)行噴灑處理，果蔬表面的細(xì)菌總數(shù)取得了預(yù)期效果，與本研究的結(jié)果一致。當(dāng)雙乙酸鈉質(zhì)量濃度為1.1 g/100 mL時(shí)，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)最小，故選取雙乙酸鈉質(zhì)量濃度為0.9、1.1、1.3 g/100 mL進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響

圖2 乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響Fig. 2 Effect of double buds Lactobacillus concentration on aerobic bacterial count of steamed carp

由圖2可知，隨著乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的增大，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì)。當(dāng)乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.21 g/100 mL時(shí)，與0.17 g/100 mL時(shí)相比，其對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。與未用乳酸雙芽菌處理的清蒸鯉魚(yú)相比，用乳酸雙芽菌處理過(guò)的鯉魚(yú)菌落總數(shù)降低，這可能是由于乳酸雙芽菌建立了酶生物合成和活性調(diào)節(jié)模式，使微生物的膜通透性增加，能量系統(tǒng)被破壞，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。當(dāng)乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.17 g/100 mL時(shí)，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)最小，故選取乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.13、0.17、0.21 g/100 mL進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.3 脈沖能量對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響

圖3 脈沖能量對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響Fig. 3 Effect of pulsed light energy on aerobic bacterial count of steamed carp

由圖3可知，隨著脈沖能量的增加，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)呈先下降后趨于平緩的趨勢(shì)。與400 J相比，當(dāng)脈沖能量增加到500 J時(shí)，其對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響顯著（P＜0.05）；與500 J相比，當(dāng)脈沖能量增加到600 J時(shí)，其對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。脈沖能量是影響脈沖強(qiáng)光殺菌效果的重要因素[25]。與對(duì)照組相比，脈沖強(qiáng)光處理過(guò)的清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)降低，這可能是由于微生物細(xì)胞具有比周圍介質(zhì)更高的脈沖吸收光[26]，脈沖強(qiáng)光處理對(duì)細(xì)胞膜造成了極大損傷，并大幅度降低了胞內(nèi)酶的活性，導(dǎo)致微生物死亡[27]。在保證殺菌效果的前提下，應(yīng)盡可能地節(jié)約能源，當(dāng)脈沖能量為500 J時(shí)，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)最小，故選取脈沖能量為400、500、600 J進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 脈沖距離對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響

圖4 脈沖距離對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響Fig. 4 Effect of light source distance on aerobic bacterial count of steamed carp

由圖4可知，隨著脈沖距離的增大，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)呈先下降后上升的趨勢(shì)。在8～14 cm范圍內(nèi)，脈沖燈光與樣品距離越近，樣品的菌落總數(shù)越小，滅菌效果也越明顯[28]。Wuytack等[29]認(rèn)為，脈沖強(qiáng)光對(duì)微生物的滅活主要是由于DNA結(jié)構(gòu)的改變，適當(dāng)?shù)拿}沖距離會(huì)增強(qiáng)殺菌效果。王勃等[30]的研究表明，當(dāng)脈沖距離為12.8 cm時(shí)，可使巴氏乳的霉菌滅菌率達(dá)99.97%，這顯示出脈沖距離對(duì)殺菌效果的積極影響。在本研究中，當(dāng)脈沖距離為8 cm時(shí)，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)最小，故選取脈沖距離為6、8、10 cm進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)及結(jié)果

采用Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，一共包括29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中包括24 個(gè)析因點(diǎn)（1～24）以及5 個(gè)零點(diǎn)（25～29）。各因素水平及編碼如表1所示，Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表 1 響應(yīng)面因素水平與編碼Table 1 Code and level of independent variables used in Box-Behnken design

表 2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with response variable

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到脈沖能量、脈沖距離、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度與菌落總數(shù)的二次回歸方程模型：Y=2.54+0.14A－0.54B－0.48C－0.11D+0.15AB+0.05AC+0.02AD+0.18BC+0.17BD+0.01CD+0.78A2+0.53B2+0.65C2+0.50D2。

表 3 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of regression model

由表3可知，所設(shè)計(jì)的模型成立，因?yàn)槟Ｐ蜆O顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)P=0.386 6＞0.05，不顯著。所得到的回歸方程的R2=0.981 0，=0.962 0，說(shuō)明該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的擬合效果很好，試驗(yàn)誤差小。因此，可用此模型分析和預(yù)測(cè)經(jīng)雙乙酸鈉和乳酸雙芽菌及脈沖強(qiáng)光殺菌處理后清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)。

模型一次項(xiàng)A、B、C、D，交互項(xiàng)AB、BC、BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)AC、AD、CD對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響不顯著（P＞0.05）。4 個(gè)因素對(duì)清蒸鯉魚(yú)菌落總數(shù)的影響大小順序?yàn)锽＞C＞A＞D，即脈沖距離＞雙乙酸鈉質(zhì)量濃度＞脈沖能量＞乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度。

2.2.2 兩因子間的交互作用分析

圖5為當(dāng)雙乙酸鈉質(zhì)量濃度為1.1 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.17 g/100 mL時(shí)，脈沖能量和脈沖距離的交互作用響應(yīng)面分析圖。由等高線圖可以看出，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)隨著脈沖能量的增加先減小后增大，且清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)也隨脈沖距離的增大先減小后增大，并且等高線圖呈橢圓形，說(shuō)明脈沖能量與脈沖距離的交互效果較好[31]。從3D響應(yīng)面圖也可以看出，響應(yīng)曲面的坡度較陡，也說(shuō)明脈沖能量和脈沖距離的交互效果顯著。

圖5 脈沖能量和脈沖距離的交互作用響應(yīng)面分析圖Fig. 5 Response surface plot showing the interaction between pulse energy and pulse distance

圖6 脈沖距離和雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的交互作用響應(yīng)面分析圖Fig. 6 Response surface plot showing the interaction between pulse distance and sodium diacetate concentration

圖6為當(dāng)乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度為0.17 g/100 mL、脈沖能量為500 J時(shí)，脈沖距離和雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的交互作用響應(yīng)面分析圖。從3D響應(yīng)面圖可以看出，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)隨著脈沖距離的增加先減小后增大，隨雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的增大先減小后增大，并且響應(yīng)曲面的坡度較陡，說(shuō)明脈沖距離與雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的交互效果較好。等高線圖呈橢圓形且較密集，也說(shuō)明脈沖距離和雙乙酸鈉質(zhì)量濃度的交互效果顯著。

圖7 脈沖距離和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的交互作用響應(yīng)面分析圖Fig. 7 Response surface plot showing the interaction between pulse distance and double buds Lactobacillus concentration

圖7為當(dāng)雙乙酸鈉質(zhì)量濃度為1.1 g/100 mL、脈沖能量500 J時(shí)，脈沖距離和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的交互作用響應(yīng)面分析圖。由等高線圖可以看出，清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)隨著脈沖距離的增加先減小后增大，也隨乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的增大先減小后增大，并且等高線圖呈橢圓形且密集，說(shuō)明脈沖距離與乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的交互效果較好。響應(yīng)曲面的坡度較陡，也說(shuō)明脈沖距離和乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度的交互效果顯著。

2.2.3 最優(yōu)組合的確定及驗(yàn)證

Design Expert V8.0.6軟件預(yù)測(cè)出的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為脈沖能量482.61 J、脈沖距離8.72 cm、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度1.15 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.17 g/100 mL，在此條件下預(yù)測(cè)清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)為2.34（lg（CFU/g））。結(jié)合實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件更改為脈沖能量480 J、脈沖距離9 cm、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度1.1 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.17 g/100 mL，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)為2.36（lg（CFU/g）），證明了該模型的可行性和有效性。

3 結(jié) 論

本研究探究了雙乙酸鈉質(zhì)量濃度、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度、脈沖能量和脈沖距離4 個(gè)因素對(duì)清蒸鯉魚(yú)滅菌效果的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面分析優(yōu)化，建立了回歸方程模型，得到最佳處理?xiàng)l件為脈沖能量480 J、脈沖距離9 cm、雙乙酸鈉質(zhì)量濃度1.1 g/100 mL、乳酸雙芽菌質(zhì)量濃度0.17 g/100 mL。結(jié)果表明，脈沖強(qiáng)光結(jié)合雙乙酸鈉及乳酸雙芽菌等保鮮劑處理可有效降低清蒸鯉魚(yú)的菌落總數(shù)，是一種有效的魚(yú)制品保鮮技術(shù)。