缺血后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12的影響

劉鴻濤

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬龍華中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 深圳 518110)

急性心肌梗死是目前世界范圍內(nèi)致病及致死的最主要原因之一。然而“缺血再灌注損傷”亦會(huì)對(duì)心肌造成損害。因此如何在心肌再灌注時(shí)對(duì)心臟進(jìn)行較好地保護(hù)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，例如局部的缺血后處理，而通過再灌注開始時(shí)的多次短暫的缺血再灌注被證實(shí)具有一定的心肌保護(hù)作用〔1〕。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道顯示可通過多種干預(yù)方式對(duì)心肌進(jìn)行保護(hù)，但具體的有效機(jī)制尚不十分明確〔2〕。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在機(jī)體的鈣離子穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)生物合成及蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮著重要作用，心肌發(fā)生缺血時(shí)常伴隨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)是細(xì)胞生存的一種自身的保護(hù)反應(yīng)，同時(shí)也可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡〔3〕。蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇必需酶(IRE)1和激活轉(zhuǎn)錄因子(ATF)6是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的觸發(fā)因子，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被觸發(fā)后將釋放出葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78，而GRP78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要標(biāo)志物之一〔4〕。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-12是半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，目前研究顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠?qū)⑵浼せ?，然后進(jìn)入細(xì)胞液激活其他的caspase家族成員，最終完成細(xì)胞的凋亡〔5,6〕。本研究建立大鼠心肌缺血再灌注損傷動(dòng)物模型，分析其在缺血后處理對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷相關(guān)蛋白GRP78及caspase-12表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組 選取雄性Wistar大鼠30只，購自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，體重250～300 g，平均(276.3±15.4)g,將大鼠編號(hào)為1～30號(hào)，通過隨機(jī)數(shù)字表將其均分為A組(空白對(duì)照組)、B組(心肌缺血再灌注損傷組)、C組(心肌缺血后處理組)，每組10只。本研究操作及相關(guān)內(nèi)容均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2手術(shù)操作 所有動(dòng)物經(jīng)腹腔注射戊巴比妥(60 mg/kg)麻醉，隨后使用16號(hào)管予以插管，同時(shí)采用小型動(dòng)物呼吸機(jī)(SAR-830 A/P,CWE)給予輔助通氣；操作過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠的體溫，使大鼠體溫保持在36～38℃，通過中部胸骨打開胸廓，去除心包后暴露心臟，將單根7號(hào)縫線置于左冠狀動(dòng)脈的近端，A組大鼠操作至此結(jié)束，曠置3 h。B、C組大鼠則進(jìn)行結(jié)扎45 min，覆蓋一小塊紗布防止動(dòng)脈損傷，通過觀察心肌的顏色改變和局部的運(yùn)動(dòng)障礙對(duì)心肌的缺血進(jìn)行確認(rèn)。誘導(dǎo)性缺血結(jié)束后取出結(jié)扎，使B組大鼠心肌組織再灌注2 h；C組大鼠則給予3個(gè)循環(huán)的10 s缺血及10 s再灌注的缺血后處理操作，之后再灌注2 h。

1.3指標(biāo)分析

1.3.1心肌梗死面積的檢測(cè) 在2 h再灌注結(jié)束后，對(duì)所有大鼠進(jìn)行安樂死處理后取出心臟，使用1%的Evans藍(lán)進(jìn)行逆行灌注顯示出危險(xiǎn)區(qū)域(AAR)，然后將心臟自頂端進(jìn)行組織切片，并在室溫下1%磷酸鹽緩沖的2,3,5-三苯基四唑氯化物溶液(TTC)中孵育，以顯示出梗死的心肌組織，后將切片置于10%甲醛中進(jìn)行固定，使用Image J軟件定量分析梗死面積。缺血面積百分比=AAR/總心室面積×100%，梗死面積百分比=梗死區(qū)域面積/缺血區(qū)域面積×100%。

1.3.2內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的免疫印跡分析 對(duì)AAR區(qū)域的心肌組織進(jìn)行Western印跡分析，A組則取類似部位心肌組織進(jìn)行檢測(cè)，將-80℃液氮內(nèi)冷凍的心肌組織粉碎后提取蛋白質(zhì)，根據(jù)產(chǎn)品的使用說明書通過Bio-Rad DC蛋白測(cè)定試劑盒(Calif)檢測(cè)蛋白濃度，后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，將膜在4℃與一抗孵育過夜，一抗為抗GRP78山羊抗體(1∶1 000，Santa Cruz)，抗caspase-12小鼠抗體(1∶500，IMGENEX)，GAPDH(小鼠抗體;Sigma-Aldrich)用作對(duì)照，二抗為抗山羊辣根過氧化物酶(1∶5 000)及抗鼠免疫球蛋白(1∶5 000)，使用Lumino-image分析儀(Fujifilm)顯示條帶的吸光度值。

1.3.3各組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)分析 依據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)在處死大鼠之前對(duì)其神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評(píng)估〔7,8〕，內(nèi)容包括：(1)整體的神經(jīng)損害評(píng)分：0分為無神經(jīng)損害，1分為對(duì)側(cè)前肢屈曲及肩關(guān)節(jié)內(nèi)收，2分為對(duì)外側(cè)推力的抵抗降低，3分為同側(cè)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)；(2)旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：使用20 r/min木條，記錄大鼠5 min內(nèi)從開始轉(zhuǎn)圈至掉落的時(shí)間；(3)懸吊實(shí)驗(yàn)：45 cm高的鐵絲，記錄大鼠從開始懸吊至掉落時(shí)的時(shí)間；(4)平衡木行走實(shí)驗(yàn)：平衡木長度60 cm，寬度5.1 cm，高度50 cm，記錄大鼠通過的時(shí)間。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠心肌梗死面積比較 A組心肌切片經(jīng)Evans藍(lán)與TTC染色處理后均呈現(xiàn)藍(lán)色，表明無缺血及梗死區(qū)域，B組與C組心肌組織切片可見紅色的缺血區(qū)域及白色的梗死病灶區(qū)域，宏觀上看B組缺血及梗死病灶面積大于C組。經(jīng)Image J軟件量化分析后顯示，與組織切片相一致的結(jié)果，即C組心肌組織的缺血面積百分比〔(41.22±8.86)%〕及梗死面積百分比〔(30.19±7.74%〕均顯著低于B組〔(56.25±10.24)%、(39.67±8.54)%;t=3.510、2.601，P=0.003、0.018〕。見圖1。

圖1 三組大鼠心肌切片染色結(jié)果

2.2三組大鼠心肌組織的Western印跡分析 A組大鼠的相應(yīng)部位心肌組織的GRP78及caspase-12蛋白表達(dá)均低于B組及C組(P<0.05)；C組大鼠的caspase-12蛋白表達(dá)低于B組，而GRP78蛋白表達(dá)高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 三組大鼠心肌組織中GRP78及caspase-12蛋白表達(dá)比較

與A組比較：1)P<0.05;與B組比較：2)P<0.05

圖2 三組大鼠Western印跡分析條帶

2.3三組大鼠神經(jīng)行為學(xué)比較 三組大鼠的神經(jīng)損害程度、旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)、懸吊實(shí)驗(yàn)以及完成平衡木行走實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)數(shù)值之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估比較

3 討 論

心肌缺血后的再灌注是緩解患者臨床癥狀及預(yù)防缺血進(jìn)一步惡化的最有效手段，但同時(shí)伴隨著再灌注損傷，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞的凋亡及梗死病灶的擴(kuò)大化〔9〕。心肌缺血后處理的積極作用最初由2003年一項(xiàng)國外的研究通過狗心肌缺血再灌注損傷發(fā)現(xiàn)，后于臨床實(shí)踐中選擇ST段抬高的急性心肌梗死患者為研究對(duì)象，經(jīng)急診冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)后給予缺血后處理能夠顯著降低心肌的梗死病灶區(qū)域面積。本研究中通過大鼠的急性心肌缺血模型亦得到類似的結(jié)果，缺血后處理操作相對(duì)于單純的缺血再灌注能夠著減少心肌的缺血及梗死面積。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)由于涉及機(jī)體的多種生理及病理過程從而發(fā)揮著重要的影響。有研究報(bào)道稱，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)在多種細(xì)胞和組織內(nèi)同時(shí)具有利弊作用，主要取決于細(xì)胞生存與凋亡間的平衡〔10〕。一項(xiàng)研究顯示，GRP78在腫瘤、腦組織及心肌缺血再灌注內(nèi)發(fā)揮著重要的細(xì)胞保護(hù)作用〔11〕；體外研究中缺血再灌注之前使用藥物激活GRP78能夠顯著減少心肌細(xì)胞的凋亡，缺血前通過二氧化硫的預(yù)處理亦能夠減小大鼠缺血心肌的梗死面積，目前認(rèn)為這些缺血預(yù)處理引起的心臟保護(hù)作用與GRP78的表達(dá)增加相關(guān)，轉(zhuǎn)染GRP78的反義寡核苷酸能夠逆轉(zhuǎn)這種保護(hù)作用。這與本研究的結(jié)果相一致，缺血后處理大鼠的GRP78蛋白表達(dá)量顯著高于單純?cè)俟嘧p傷的大鼠模型，組織病理學(xué)同樣證實(shí)缺血后處理對(duì)減少心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)的心肌保護(hù)作用。但有部分研究報(bào)道缺血再灌注2 h后缺血后處理能夠降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)，主要表現(xiàn)為鈣網(wǎng)織蛋白的降低〔12〕，因此有必要綜合多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)標(biāo)志物及多個(gè)采集時(shí)間點(diǎn)以進(jìn)一步加以證實(shí)。

人體內(nèi)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)等與caspase家族具有密切關(guān)聯(lián)，有研究證實(shí)，caspase-12能夠在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)激活，然后進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡通路從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔13〕。多種外界的物理、化學(xué)、放射、缺氧等刺激均可引起細(xì)胞內(nèi)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激，最終的凋亡均與caspase-12相關(guān)〔14〕。本研究結(jié)果顯示單純的心肌缺血再灌注能夠使心肌細(xì)胞內(nèi)caspase-12表達(dá)增加，宏觀上顯示心肌的缺血及梗死病灶增加，而缺血后的處理操作能夠使其表達(dá)降低，從而減少心肌細(xì)胞的凋亡，缺血及梗死面積減少。

另外，本研究存在一定的局限性，首先表現(xiàn)在納入研究的動(dòng)物數(shù)量較少，同時(shí)未納入所有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的主要標(biāo)記物及凋亡相關(guān)的其他通路蛋白，未對(duì)再灌注后的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)化分析，因此獲得的結(jié)論力度欠佳，但本研究的結(jié)果初步證實(shí)對(duì)于大鼠的心肌缺血再灌注損傷模型，缺血后的處理能夠一定程度上減少心肌缺血及梗死的面積。其作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)增加相關(guān)，表現(xiàn)為GRP78標(biāo)志物的表達(dá)增加，并且這種應(yīng)激能夠通過抑制凋亡通路降低心肌細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)缺血心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，改善患者心功能和生存預(yù)后。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)估結(jié)果顯示心肌的缺血再灌注損害并未對(duì)大鼠的神經(jīng)行為學(xué)產(chǎn)生顯著影響，可能與缺血再灌注的時(shí)間較短相關(guān)。