一氧化氮合酶調(diào)節(jié)姜黃素對(duì)非小細(xì)胞肺癌遷移和侵襲的作用及機(jī)制

陸益民 虞樂群 石 磊

(江蘇大學(xué)附屬昆山市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 昆山 215300)

一氧化氮合酶(NOS)在多種腫瘤組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤侵襲和遷移，腫瘤血管分化和形成關(guān)系密切〔1〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)NOS表達(dá)水平明顯高于小細(xì)胞肺癌〔2〕。姜黃素為一種中藥提取物，主要從中藥姜黃根莖提取，具有抗炎、抗血管增生、抗腫瘤增殖等多種作用。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)一定濃度的姜黃素可有效抑制NSCLC肺癌增殖〔2〕，但對(duì)NSCLC遷移和侵襲能力的作用及其機(jī)制不明確。本研究旨在探討NOS調(diào)節(jié)姜黃素對(duì)NSCLC的遷移和侵襲的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人NSCLC A549細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。姜黃素購自美國Sigma生物有限公司。RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司。重組人工基底膜Matrigel購自美國BD公司。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試劑盒購自南京碧云天生物科技公司。誘生型NOS(iNOS)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9和E-cad抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。一氧化氮(NO)Griess檢測(cè)試劑盒購自Biovision公司。Transwell小室購自Corning Costar公司。購買人iNOS質(zhì)粒iNOS-Pcr4-TOPO(美國Open Biosystems公司)和真核表達(dá)質(zhì)粒載體pVAX(Invitrogen公司)構(gòu)建pVAX-iNOS過表達(dá)載體。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2孵箱中，隔天更換培養(yǎng)基，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化后傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/L，種植于96孔板，每孔100 μl，24 h后加無血清杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，使細(xì)胞同步化于靜止期。棄上清，加入不同濃度姜黃素(20、40、80、160 μmol/L)， 每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)72 h,棄上清，每孔加10 μl MTT和100 μl無血清DMEM培養(yǎng)液， 繼續(xù)培養(yǎng)4 h,去培養(yǎng)液,加100 μl二甲亞砜37℃孵育10 min完全溶解， 酶標(biāo)儀以測(cè)量波長(zhǎng)490 nm測(cè)吸光度值。抑制率(%)=〔 1 -(藥物組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)〕×100%。

1.4Transwell遷移和侵襲試驗(yàn) 侵襲實(shí)驗(yàn)先使用Matrigel膠包被Transwell小室，而遷移實(shí)驗(yàn)無需用Matrigel膠包被Transwell小室。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞(姜黃素濃度分別為20、40、80、160 μmol/L)和含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的RPMI1640培養(yǎng)基制成濃度為5×104/ml的細(xì)胞懸液，加于上室；將含有10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基加于下室，設(shè)定3個(gè)平行孔，培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的非侵襲細(xì)胞，倒置風(fēng)干后，0.1%結(jié)晶紫染色、計(jì)數(shù)。

1.5Western印跡鑒定 各組細(xì)胞處理后提取總蛋白，加入上樣緩沖液，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，125 mA電流下4 ℃轉(zhuǎn)膜120 min，封閉2 h，一抗(1∶200)稀釋后37℃孵育1.5 h，漂洗3次，每次5 min，孵育二抗1.5 h后漂洗，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL，Pierce公司)顯影，凝膠成像儀成像。β-actin檢測(cè)作為內(nèi)對(duì)照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響 不同濃度姜黃素 (20、40、80、160 μmol/L)作用24～72 h后，A549細(xì)胞表現(xiàn)出細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，并且這樣抑制程度與姜黃素藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)。160 μmol/L姜黃素作用A549細(xì)胞24 h可達(dá)到半數(shù)抑制率,約47.3%。見圖1。

2.2姜黃素對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響 不同濃度姜黃素 (20、40、80、160 μmol/L)作用24 h后，A549細(xì)胞穿過未包被Matrigel膠的Transwell小室計(jì)數(shù)隨著藥物的濃度增加，穿過細(xì)胞數(shù)逐漸減少。不同濃度姜黃素干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明細(xì)胞遷移能力隨著姜黃素濃度的增加而降低。見圖2。

2.3姜黃素對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響 不同濃度姜黃素 (20、40、80、160 μmol/L)作用24 h后，A549細(xì)胞侵襲穿透Matrigel成膠人工基底膜的細(xì)胞計(jì)數(shù)也隨著藥物的濃度增加，穿透細(xì)胞數(shù)逐漸減少。不同濃度姜黃素干預(yù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明細(xì)胞侵襲能力隨著姜黃素濃度的增加而降低。見圖3。

圖1 不同濃度姜黃素對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

圖2 不同濃度姜黃素對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響(×200)

圖3 不同濃度姜黃素對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響(×200)

2.4姜黃素對(duì)A549細(xì)胞iNOS、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)的影響 根據(jù)IC50，選擇160 μmol/L姜黃素作用于A549細(xì)胞24 h，與對(duì)照組(1.0)相比，160 μmol/L姜黃素作用后iNOS(0.13±0.03)、MMP-2(0.23±0.07)和MMP-9表達(dá)(0.07±0.02)顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞iNOS、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)的影響

2.5姜黃素對(duì)A549細(xì)胞NO生成的影響 作用24～72 h后，不同濃度姜黃素可有效抑制A549細(xì)胞生成NO的能力，并隨著藥物濃度增加，抑制力增強(qiáng)(P<0.05)。見表1。

表1 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞產(chǎn)生NO能力的影響

與姜黃素0 μmol/L比較：1)P<0.05；與24 h比較：2)P<0.05

2.6過表達(dá)iNOS逆轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)A549細(xì)胞的遷移和侵襲作用 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pVAX-iNOS過表達(dá)載體24 h后iNOS蛋白明顯升高(3.61±0.71 vs 1.00±0.30)。轉(zhuǎn)染pVAX-iNOS過表達(dá)載體顯著扭轉(zhuǎn)姜黃素對(duì)A549細(xì)胞的遷移和侵襲作用(P<0.05)。見圖5和圖6。

圖5 姜黃素對(duì)A549細(xì)胞的遷移和侵襲作用(×200)

圖6 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pVAX-iNOS過表達(dá)載體后iNOS蛋白表達(dá)水平

3 討 論

機(jī)體內(nèi)NOS通過生成NO參與調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生理過程。生成的NO參與腫瘤血管形成及腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲〔3〕。由此，推測(cè)NOS也可能參與調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Assawasuparek等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)Scabraside D可通過抑制NOS表達(dá)抑制膽管癌細(xì)胞侵襲能力。體內(nèi)NOS一般包括三種異構(gòu)酶形式，分別為內(nèi)皮型(eNOS)、神經(jīng)型(nNOS)和iNOS。而iNOS與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切〔5〕。研究表明iNOS主要由腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在病理過程中產(chǎn)生。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生iNOS后，可進(jìn)一步催化產(chǎn)生大量的NO，而NO進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管增生和細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。

iNOS產(chǎn)生與肺癌關(guān)系密切〔6〕。iNOS在肺癌組織中含量要明顯高于正常對(duì)照肺組織。其在肺鱗癌早期病變階段的組織中便呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，隨著肺鱗癌的進(jìn)展，其表達(dá)水平也逐漸增高。肺癌的分化越差，iNOS表達(dá)的陽性率就越高。但有研究發(fā)現(xiàn)iNOS在小細(xì)胞肺癌中表達(dá)并不是十分高，而在非小細(xì)胞肺癌中呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)。李牧等〔1〕發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的iNOS與宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。但iNOS與NSCLC的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系至今尚未明確。

姜黃素是從植物姜黃的根莖提取的一種有效的廣譜抗腫瘤成分〔7〕。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素可抑

制NSCLC細(xì)胞增殖。姜黃素可有效抑制NSCLC侵襲和遷移能力，并且與姜黃素濃度相關(guān)。姜黃素的這種抑制能力與NSCLC的iNOS表達(dá)水平有關(guān)，姜黃素可有效抑制NSCLC的iNOS表達(dá)；相反，pVAX-iNOS過表達(dá)載體上調(diào)NSCLC細(xì)胞內(nèi)iNOS表達(dá)水平后，姜黃素抑制NSCLC侵襲和遷移能力明顯下降。有研究表明iNOS 可調(diào)節(jié)MMPs表達(dá)水平，而后者與細(xì)胞侵襲和遷移能力關(guān)系密切〔4〕。MMP-2和9是侵襲相關(guān)蛋白，可降解細(xì)胞基底膜膠原蛋白，其高表達(dá)可顯著提高惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力。綜上，姜黃素可有效抑制NSCLC增殖，同時(shí)抑制其遷移和侵襲，其后者機(jī)制可能與iNOS相關(guān)信號(hào)通路受到抑制有關(guān)。