高遷移率族蛋白B1、Toll樣受體4在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)及意義

王 敬 陳冠男 呂 琪 肖培欣 孫淑麗 樊毫軍 丁 輝 劉子泉 侯世科

(錦州醫(yī)科大學(xué)武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，天津 300162)

膿毒癥是機(jī)體出現(xiàn)感染后的全身性反應(yīng)，嚴(yán)重者可誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征。研究〔1〕發(fā)現(xiàn)有高度可疑感染灶或細(xì)菌存在，病情可發(fā)展為急性器官衰竭，誘發(fā)嚴(yán)重膿毒癥，嚴(yán)重患者還可出現(xiàn)體液復(fù)蘇不可逆轉(zhuǎn)的低血壓進(jìn)入膿毒性休克階段，但相關(guān)發(fā)病機(jī)制尚不明晰。高遷移率族蛋白(HMG)B1廣泛分布于高等真核生物細(xì)胞核中，是一類(lèi)高度保守的蛋白質(zhì)。HMGB1是膿毒癥晚期炎性反應(yīng)因子，其作為一種重要的致炎細(xì)胞因子和炎性反應(yīng)介質(zhì)，其與膿毒癥性心肌損害的相關(guān)性的研究資料較缺乏〔2〕。Toll樣受體(TLR)4歸屬于TLRs家族，其與膿毒癥及心血管疾病方面已有部分探索性研究〔3〕。本研究探討HMGB1、TLR4在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取清潔級(jí)SD大鼠50只，雌雄各半，體重250～300 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，術(shù)前禁食12 h，自由飲水，隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組，其中模型組再分為模型12、24、48 h組，每組10只。

1.2膿毒癥大鼠模型制備 采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥大鼠模型，大鼠禁水、禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥麻醉后固定，常規(guī)消毒鋪巾后腹部正中切口，暴露并游離盲腸，模型組：4號(hào)線(xiàn)距盲腸末端結(jié)腸，18號(hào)針頭盲腸游離末端穿孔，放回盲腸復(fù)位，關(guān)腹縫合。假手術(shù)組：不穿孔、不結(jié)扎盲腸，放回盲腸復(fù)位，關(guān)腹縫合。模型組分別于造模結(jié)束后24 h內(nèi)采集標(biāo)本后處死〔4〕。

1.3標(biāo)本采集及保存 各組水合氯醛麻醉后腹主動(dòng)脈取血2 ml后3 000 r/min 10 min離心取上清后-80℃條件下保存待檢；打開(kāi)大鼠胸腔分離心臟后將右心部分心肌組織10%甲醛固定。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 心肌組織勻漿后，3 000 r/min 10 min離心，取上清后-80℃條件下保存待檢，酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)TLR4表達(dá)，試劑盒購(gòu)于南京建成生物研究所，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5免疫組化染色 免疫組化染色檢測(cè)心肌組織HMGB1表達(dá)，SP法對(duì)心肌組織進(jìn)行免疫組化染色，心肌組織常規(guī)石蠟切片，脫蠟水化后，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，抗原修復(fù)后PBS沖洗3次，滴加山羊血清室溫孵育20 min，PBS沖洗3次，滴加SP后室溫孵育30 min，PBS沖洗3次后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染〔5〕。

1.6病理組織學(xué)觀察 取10%甲醛固定后的右心室心肌組織，石蠟包埋后常規(guī)切片，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理情況。

1.7實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HMGB1和TLR4 mRNA表達(dá)，取心肌組織后Trizol法常規(guī)提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cRNA。大鼠HMGB1引物和TLR4引物和實(shí)時(shí)PCR條件均參照鄭世翔等〔6〕的研究。所有待檢標(biāo)本設(shè)立3個(gè)平行孔，各標(biāo)本HMGB1和TLR4基因定量值取循環(huán)數(shù)并與相應(yīng)內(nèi)參基因CT差值為標(biāo)準(zhǔn)HMGB1和TLR4基因表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t、F檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組心肌組織病理觀察 正常對(duì)照組和假手術(shù)組心肌基本正常，模型12、24、48 h組大鼠可見(jiàn)心肌細(xì)胞水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)血管充血，心肌細(xì)胞壞死明顯。見(jiàn)圖1。

圖1 各組心肌病理學(xué)改變(HE，×400)

2.2各組心肌組織HMGB1和TLR4蛋白和mRNA表達(dá) 模型12、24、48 h組心肌組織HBGB1的OD值和TLR4蛋白和mRNA明顯高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組(P<0.05)，其中模型24 h組心肌組織HBGB1的OD值和TLR4蛋白和mRNA明顯高于模型12、48 h組(P<0.05)。見(jiàn)圖2和表1。

2.3相關(guān)性 HMGB1 mRNA和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.611，P<0.05)。

圖2 各組心肌組織HMGB1免疫組化染色(×400)

組別HMGB1 OD值TLR4(ng/ml)HMGB1 mRNATLR4 mRNA正常對(duì)照組0.243±0.08410.22±1.431.000±0.0111.000±0.010假手術(shù)組0.231±0.09010.45±1.500.998±0.0101.000±0.090模型12 h組0.581±0.1141)2)17.84±4.241)2)2.104±0.2011)2)2.404±0.3111)2)模型24 h組0.846±0.1031)2)3)24.18±4.101)2)3)3.511±0.4141)2)3)3.671±0.5011)2)3)模型48 h組0.622±0.0971)2)3)4)20.25±3.841)2)3)4)1.712±0.1241)2)3)4)1.821±0.2141)2)3)4)F/P值12.034/<0.0511.816/<0.058.114/<0.059.465/<0.05

1)與正常對(duì)照組比較:；2)與假手術(shù)組比較；3)與模型12 h組比較；4)與模型24 h組比較:均P<0.05

3 討 論

膿毒癥主要是指機(jī)體對(duì)感染的特異性反應(yīng)進(jìn)而誘發(fā)多器官功能障礙，其中心肌損傷是重要表現(xiàn)，具有病情嚴(yán)重、進(jìn)展速度快等特點(diǎn)，可對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生直接影響〔7〕。心臟收縮和舒張功能損害以心臟擴(kuò)大、左室射血分?jǐn)?shù)下降為主要特征，是膿毒癥心肌損傷的主要表現(xiàn)，而誘發(fā)心肌損傷的機(jī)制較復(fù)雜，目前仍不明確，主要為以下幾點(diǎn)：①線(xiàn)粒體功能障礙；②細(xì)胞因子和細(xì)菌毒素作用；③心肌細(xì)胞Ca2+超載；④腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活；⑤心肌細(xì)胞凋亡等〔8～10〕。本研究結(jié)果說(shuō)明膿毒癥大鼠體內(nèi)存在較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)。HMGB1主要作為促炎癥因子對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行介導(dǎo)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)膿毒癥患者體內(nèi)血清HGMB1水平顯著升高并提示HMGB1可阻斷胰高血糖素樣肽(GLP)誘導(dǎo)的膿毒癥或內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而提高小鼠的生存率〔11〕。TLR4在人體內(nèi)分布廣泛，主要分布在外周血白細(xì)胞和淋巴組織，在心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有分布，參與宿主防御功能細(xì)胞上均存在TLR4表達(dá)〔12〕。研究〔13〕發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血/再灌注損傷、心力衰竭等均有TLR4在心血管方面發(fā)揮作用。本研究結(jié)果說(shuō)明HMGB1和TLR4在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)上調(diào)，可能在膿毒癥心肌損傷中有重要作用。

心肌組織中HMGB1水平升高主要有以下三方面的原因：①被白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α和脂多糖(LPS)等激化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等通過(guò)時(shí)間-劑量依賴(lài)的方式將核內(nèi)HMGB1釋放到細(xì)胞外；②組織損傷、壞死細(xì)胞、再灌注損傷及缺氧等導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1被動(dòng)釋放；③活化的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞促進(jìn)HMGB1等多種細(xì)胞因子的合成與分泌并通過(guò)正反饋效應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)甚至延長(zhǎng)機(jī)體炎癥反應(yīng)〔14〕。TLR4在膿毒癥心肌損傷過(guò)程中亦發(fā)揮重要的作用，可通過(guò)對(duì)Bcl-2/Bax、Fas/Fas配體等凋亡相關(guān)基因的調(diào)控進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷；TLR4還可介導(dǎo)信號(hào)通路激活核因子(NF)-κB，增加IL-1和TNF-α等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)而最終導(dǎo)致膿毒癥〔15〕。本研究中大鼠心肌組織中HMGB1和TLR4表達(dá)上調(diào)證實(shí)兩種蛋白與膿毒癥存在一定的相關(guān)性，并提示可能通過(guò)調(diào)控HMGB1和TLR4蛋白表達(dá)來(lái)預(yù)防膿毒癥心肌損傷。