秦嶺滑蜥視網膜年齡相關的顯微結構特征和膠質纖維酸性蛋白免疫組織化學定位

高燕燕， 李琳， 趙禹， 朱妞， 楊純

(山西師范大學生命科學學院，山西臨汾041004)

蜥蜴亞目Sauria視網膜結構和機能與各自的生活習性一致(張育輝，賈林芝，2003)，且具有特殊的視覺再生能力(Langetal.，2002)。視網膜結構的增齡改變必然影響機體的視覺功能(孫慶艷等，2004)。膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在星形膠質細胞中的表達可反映其功能活動狀態(tài)(Biginietal.，2001；Williams，2017)。視網膜Müller細胞中表達GFAP是成體脊椎動物的共同特征(Sassoèetal.，1992)。GFAP在無蹼壁虎Gekkoswinhonis視網膜中的分布特點及年齡相關性變化，提示Müller細胞可能通過增強或減弱GFAP表達參與視網膜衰老過程中的生理功能調節(jié)(王智超等，2008)。

秦嶺滑蜥Scincellatsinlingensis是我國特有的卵胎生蜥蜴(趙爾宓，1999)，為《國家保護的有益的或者有重要經濟、科學研究價值的野生動物名錄》收錄物種(王志寶，2000)，相關研究局限于其部分器官系統(tǒng)的組織形態(tài)學(謝權等，2012；王麗敏等，2015，2016；Yang & Wang，2016；Yangetal.，2017)，尚無視網膜顯微結構增齡性變化的相關報道。因此，對秦嶺滑蜥幼體、亞成體和成體視網膜結構以及GFAP陽性表達變化進行探究，旨在積累蜥蜴類爬行動物視覺器官發(fā)育的基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

秦嶺滑蜥采自山西省霍州市太岳山七里峪林區(qū)(110°40′～112°21′E，36°21′～36°45′N)，雌雄兼有。根據吻肛長(SVL)分為幼體組(SVL<48.08 mm)、亞成體組(48.08 mm≤SVL≤57.08 mm)、成體組(SVL>57.08 mm)(馬小梅，計翔，2001；王麗敏，2016)，每組6只。實驗動物經乙醚麻醉致死后，剝離眼球，置于不同固定液中。

1.2 常規(guī)組織化學染色

材料經Bouin’s液固定后，梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，8 μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色。

1.3 免疫組織化學染色

材料經4%多聚甲醛固定過夜后，放入蔗糖溶液中梯度脫水，OCT包埋劑包埋，連續(xù)冰凍切片，切片厚度20 μm，-20 ℃保存，用于GFAP免疫組織化學染色。反應流程依次為：4%多聚甲醛后固定30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗(0.1 mol·L-1，pH7.2～7.6)，5 min×3次；3%H2O2室溫下避光20 min；PBS浸洗，5 min×3次；5%BSA封閉液，室溫孵育30 min；滴加一抗：Rabbit anti-GFAP(1∶200，博士德)，4 ℃孵育過夜；PBS浸洗，5 min×3次；滴加二抗：生物素標記羊抗兔IgG(博士德)，37 ℃孵育4 h；PBS浸洗，5 min×3次；滴加SABC(博士德)，37 ℃孵育30 min；PBS浸洗，5 min×3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色；水溶性封片劑封片。陰性對照實驗采用PBS代替一抗，其余步驟同上。

1.4 觀察與統(tǒng)計分析

切片于Olympus BX-51光學顯微鏡成像系統(tǒng)下進行觀察，拍照。每張切片隨機選取8個視野測量視網膜總厚度及各層厚度(單位：mm)。利用ImageJ隨機選取10個視野(40×10)，測定各組視網膜GFAP免疫陽性細胞的平均灰度值?；叶确譃?～256級，值越小，免疫陽性反應越強。采用SPSS 17.0中的Kolmogorov-Smirnov檢驗所得實驗數據符合正態(tài)分布后，再進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)。實驗結果以平均值±標準誤表示，顯著性水平設置為α=0.01(楊純，張育輝，2003)。

2 結果

2.1 秦嶺滑蜥視網膜顯微結構

光學顯微鏡下可見秦嶺滑蜥視網膜從內到外共分為10層：內界膜、神經纖維層、神經節(jié)細胞層、內網狀層、內核層、外網狀層、外核層、外界膜、視桿視錐層、色素上皮層(圖版Ⅰ：1～3)。內界膜為無細胞結構的單層薄膜；神經纖維層從視網膜的四周伸向中央視盤，中間厚、邊緣??；神經節(jié)細胞層分布密度不均，從中央到邊緣由稠密逐漸稀疏，胞核較大，核仁明顯；內網狀層最厚，由雙極細胞的軸突、無長突細胞的樹突和節(jié)細胞的樹突組成；內核層3～5層，胞核圓，分布有雙極細胞、水平細胞、無長突細胞、網間細胞和Müller細胞等；外網狀層主要是內核層的纖維末梢與內核層的水平細胞、雙極細胞的神經突起接合的地方，也含有Müller細胞的纖維側枝；外核層由2層感光細胞核組成，核周質較少，2層細胞核交錯排列，靠近外界膜一層的核較大，卵圓形，為視錐細胞核，靠近外網狀層一層的核較小，圓形，為視桿細胞核；外界膜由Müller細胞的外突以及視桿細胞和視錐細胞的連接復合體形成；視桿視椎層由視桿細胞和視錐細胞的內、外節(jié)組成；色素上皮層位于視網膜最外側，細胞呈柱形，胞核偏于外側，胞質內密布黑色素顆粒，大量含有色素顆粒的突起向內延伸至緊鄰的視桿視錐層的外節(jié)處，與脈絡膜交界。

2.2 不同年齡組視網膜各層厚度和胞核數的比較

不同年齡組秦嶺滑蜥視網膜的10層結構均清晰易辨(圖版Ⅰ：1～3)。單因素方差分析結果顯示，亞成體和成體視網膜總厚度較幼體明顯增加(P<0.01)，但三者之間的神經節(jié)細胞層、外界膜以及視桿視錐層厚度無明顯差異。從幼體經亞成體到成體，神經纖維層、內網狀層、內核層、外網狀層、外界膜逐漸增厚，而內界膜、神經節(jié)細胞層、外核層、色素上皮層、視桿視錐層先增厚再變薄。與幼體相比，亞成體視網膜中內界膜和外核層厚度顯著增加，其他無明顯差異；成體視網膜中神經纖維層、內網狀層、內核層、外網狀層、外核層和色素上皮層厚度顯著增加(表1)。

表1 不同年齡組秦嶺滑蜥視網膜各層厚度比較Table 1 The thickness of the retinal layers of Scincella tsinlingensis at different ages

注： 同行數據中， 標有完全不同的小寫字母表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)

Note： In the same column， difference is significant with the completely different lowercase letters (P<0.01)

秦嶺滑蜥個體發(fā)育過程中，視網膜細胞核層數變化不大。外核層和神經節(jié)細胞層細胞核層數相當，內核層細胞核數目較多(表2)。

表2 不同年齡組秦嶺滑蜥視網膜細胞核層數Table 2 Layer number of nucleus in the retina of Scincella tsinlingensis at different ages

2.3 不同階段視網膜GFAP陽性表達變化

不同年齡組視網膜GFAP免疫陽性主要定位于內界膜和神經纖維層，且以神經纖維層陽性最強。GFAP陽性表達呈現成體最強、幼體較強、亞成體最弱的年齡相關性(表3)。在亞成體階段，可觀察到視桿視錐層有少量GFAP陽性表達，視網膜其余各層均未見GFAP陽性表達(圖版Ⅰ：4～9)。

表3 不同年齡組秦嶺滑蜥視網膜膠質纖維酸性蛋白表達灰度值比較Table 3 Comparison of the gray levels of retinal glial fibrillary acidic protein expression of Scincella tsinlingensis at different ages

注Note：*P<0.01

圖版Ⅰ 不同年齡組秦嶺滑蜥視網膜結構及膠質纖維酸性蛋白的陽性表達
PlateⅠ Microstructure and immunohistochemical localization of glial fibrillary acidic protein (GFAP) in the retina ofScincellatsinlingensisat different ages

1～3. 秦嶺滑蜥視網膜各層結構(1. 幼體， 2. 亞成體， 3. 成體)， 4～9. 秦嶺滑蜥視網膜GFAP免疫組織化學定位， GFAP陽性細胞呈棕黃色(4、 7. 幼體， 5、 8. 亞成體， 6、 9. 成體)； RPE. 色素上皮層， RCL. 視桿視錐層， OLM. 外界膜， ONL. 外核層， OPL. 外網狀層， INL. 內核層， IPL. 內網狀層， GCL. 神經節(jié)細胞層， NFL. 神經纖維層， ILM. 內界膜

1-3. the microstructure of the retinal layers (1. juvenile， 2. subadult， 3. adult)， 4-9. immunohistochemical localization of GFAP in the retina， GFAP positive cells are brown (4， 7. juvenile， 5， 8. subadult， 6， 9. adult)； RPE. retinal pigment epithelium， RCL. layer of rods and cones， OLM. outer limiting membrane， ONL. outer nuclear layer， OPL. outer plexiform layer， INL. inner nuclear layer， IPL. inner plexiform layer， GCL. ganglion cells layer， NFL. nerve filament layer， ILM. inner limiting membrane

3 討論

秦嶺滑蜥的視網膜結構與大多數脊椎動物相似，從內到外共分為10層。晝行性動物和夜行性動物視網膜的主要差異之一是感光細胞和神經節(jié)細胞的數目之比不同。前者視網膜、外核層和神經節(jié)細胞層的細胞數目相當，且細胞核層數較少，內核層細胞核數目較多，而后者視網膜外核層的細胞數目遠多于神經節(jié)細胞層(鮑義恒，陳云俊，1979；王厚華等，1980；張育輝，劉家坤，1994；張育輝，賈林芝，2003)。秦嶺滑蜥視網膜的外核層和神經節(jié)細胞層細胞數目之比均相當，細胞核層數上，外核層1～2層，神經節(jié)細胞層3～4層，而內核層6～8層，符合晝行性動物視網膜的特征，故推測秦嶺滑蜥為晝行性動物。

秦嶺滑蜥、銅蜥Lygosomaindicum、北草蜥Takydromusseptentrionalis及麗斑麻蜥Eremiasargus均為晝行性動物，捕食主要依賴視覺，視網膜總厚度相近，各層厚度也較接近，其中，視桿視錐層和外核層細胞核層數均較少，相對較薄，且以視錐細胞的錐部為主，視錐細胞比視桿細胞粗短，細胞核較少但直徑較大；它們與夜行性或晨昏性活動的無蹼壁虎、耳疣壁虎Gekkoauriverrucosus視網膜總厚度相差較大，后者的視桿視錐層和外核層細胞核層數均較多，相對較厚，以視桿細胞為主，且比視錐細胞細長而密集，細胞核較多但直徑較小，這有助于增加吸收光線的面積，從而提高光敏度，有利于夜間活動(張育輝，賈林芝，2003)。秦嶺滑蜥亞成體和成體視網膜總厚度較幼體明顯增加，但三者神經節(jié)細胞層、外界膜以及視桿視錐層厚度之間無明顯差異。幼體視桿視錐層較薄，其中視桿細胞較多而視錐細胞較少，與其活動性較弱相適應。亞成體活動性逐漸增強，視網膜的視桿視錐層亦增厚，利于白天活動。成體視桿視錐層最薄，視桿視錐層結構改變，主要由視錐細胞較為粗短的錐部組成。與幼體相比，亞成體和成體視網膜總厚度增加極顯著，亞成體視網膜中內界膜和外核層厚度顯著增加，成體視網膜中神經纖維層、內網狀層、內核層、外網狀層、外核層和色素上皮層厚度顯著增加。上述結果表明，秦嶺滑蜥視網膜各層厚度與年齡呈相關性，反映其視覺功能的發(fā)育特點。

GFAP是膠質細胞特有的一種中間絲蛋白，用于標記分化的膠質細胞(Sueishietal.，1996；孫慶艷等，2004)，參與細胞支架重組、髓鞘形成、細胞黏附和信號轉導等復雜過程(Biginietal.，2001；薛黎萍等，2010；鄧海波等，2012)。GFAP主要在秦嶺滑蜥視網膜神經纖維層的Müller細胞中分布，與Sassoè等(1992)的報道一致：Müller細胞內側端的胞體、突起和膨大的終足是GFAP陽性顆粒分布的主要區(qū)域。GFAP陽性表達呈現幼體較強，亞成體最弱，而成體最強的年齡相關性。秦嶺滑蜥幼體階段視網膜Müller細胞表達GFAP較強，這可能是由于Müller細胞膠質化增生在視網膜早期階段具有修復作用(鄧海波等，2012)。Müller細胞中GFAP表達變化類似星形膠質細胞損傷后的反應，星形膠質細胞GFAP表達增加表現為反應性星形膠質化，且GFAP在其細胞內的分布對于星形膠質細胞突起的形成和結構穩(wěn)定至關重要(柯技等，2007)。Müller細胞與吞噬細胞相似，能夠清除神經元變性壞死產生的碎片及代謝產物，避免這些物質對周圍存活神經元產生毒性作用，并且活化的Müller細胞能夠合成和分泌多種細胞因子，如神經生長因子(NGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、細胞粘連分子(跨膜糖蛋白CIM)、層粘連蛋白、纖維粘連蛋白及其他細胞外基質組成成分(Hottaetal.，1995)，對維持神經元的生存、發(fā)育、再生和分化有重要作用(Schellinietal.，1995)。據此推測Müller細胞能夠維持秦嶺滑蜥視網膜穩(wěn)定，對視神經增殖和生長發(fā)育也有一定的影響，為再生視網膜神經細胞提供豐富的黏著基質，從而起支持作用(Romero-Alemánetal.，2004；王智超等，2008)。

綜上所述，秦嶺滑蜥視網膜結構與其生活習性相適應，GFAP陽性表達的年齡相關性變化反應其視覺功能的發(fā)育特點，并可能與視網膜的生理功能調節(jié)相關。