應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒別寄生紫薇絨蚧的跳小蜂

張澤源， 秦耀光， 李樞強(qiáng)*

(1. 中國人民大學(xué)附屬中學(xué)分校，北京100080；2. 中國科學(xué)院動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京100101)

紫薇絨蚧Acanthococcus(=Eriococcus)lagerstroemiae隸屬于半翅目Hemeptera氈蚧科Eriococcidae，常被稱為紫薇絨粉蚧、石榴氈蚧、石榴絨粉蚧，在我國分布廣泛(趙洋民等，1997；姜年俊，許惠，1998；賀冬英等，2008；趙文娟等，2016)，國外分布于韓國、日本等，是危害石榴PunicagranatumL.和紫薇LagerstroemiaindicaL.的主要害蟲(張欽書，孟慶喜，1990；馬金華，2011)。2004年紫薇絨蚧首次在北美被發(fā)現(xiàn)，目前在美國12個(gè)州有分布(Merchantetal.，2014；Wangetal.，2016)，被認(rèn)為是危害紫薇的重要入侵生物(Wangetal.，2016)。隨著農(nóng)藥應(yīng)用比重減小，利用寄生蜂防治紫薇絨蚧變得日益重要。

姜年俊和許惠(1998)、焦浩和張玉俊(2011)在紫薇絨蚧防治研究中提到了寄生蜂的作用，但未明確具體的種類。根據(jù)徐志宏和黃建(2004)的記載，寄生紫薇絨蚧的跳小蜂有4種：絨蚧闊柄跳小蜂Metaphycus(=Aphycus)eriococci、綿蚧闊柄跳小蜂Metaphycuspulvinariae、絨蚧亞翅跳小蜂Submicroteryseriococci和食絨蚧亞翅跳小蜂Submicroteryseriococcophagus，但是否均寄生紫薇絨蚧需進(jìn)一步核實(shí)。準(zhǔn)確鑒定寄生紫薇絨蚧的跳小蜂物種是研究其生物學(xué)特性及保護(hù)與利用的前提和基礎(chǔ)。但跳小蜂種類多、個(gè)體微小(通常為1～2 mm)，利用形態(tài)特征鑒定時(shí)常常需要制作玻片標(biāo)本并在顯微鏡下觀察分類特征。另外，隱存種現(xiàn)象在昆蟲中非常普遍(Bickfordetal.，2007)，營寄生生活昆蟲的該現(xiàn)象可能更加突出(Smithetal.，2008)，這導(dǎo)致僅依靠形態(tài)特征對(duì)跳小蜂進(jìn)行種類鑒定變得愈加困難，而且容易產(chǎn)生誤差。DNA條形碼技術(shù)作為一種輔助物種鑒定的工具(Hebertetal.，2003)，近年來得到了廣泛應(yīng)用，在昆蟲鑒定方面應(yīng)用前景廣闊(肖金花等，2004；張合彩，喬格俠，2008；宋南等，2013)。近幾年，該技術(shù)在寄生蜂鑒定中同樣表現(xiàn)出很高的應(yīng)用價(jià)值(Zhou MJetal.，2012；Zhou QSetal.，2014)，不但解決了一些近緣種、隱存種等分類學(xué)難題，同時(shí)也對(duì)闡明寄生蜂對(duì)寄主的?；云鸬搅酥匾饔?Zhangetal.，2011；Chestersetal.，2012；Zhouetal.，2018)。

本研究首先對(duì)寄生紫薇絨蚧的跳小蜂種類做了野外調(diào)查，獲取了北京、山東、江蘇、江西、湖北、湖南、云南、黑龍江、內(nèi)蒙古、廣西、寧夏、四川、山西和海南的跳小蜂樣本。針對(duì)跳小蜂體型小、外部形態(tài)變異程度難以把握等分類中的難題，采用分子生物學(xué)方法，利用線粒體COⅠ基因的特異性片段(DNA條形碼)來區(qū)分和識(shí)別寄生紫薇絨蚧的幾種跳小蜂，為今后紫薇絨蚧寄生蜂的快速鑒定和深入系統(tǒng)研究提供有效數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 樣本的采集、保存和鑒定

本研究中的寄生蜂，除特別指出，均是育自紫薇絨蚧的若蟲或雌成蟲，紫薇絨蚧的采集和飼養(yǎng)方法參考Zhang等(2011)。野外采集帶有紫薇絨蚧的老齡若蟲或成蟲的植物枝條并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室觀察。在室內(nèi)將帶有紫薇絨蚧若蟲或成蟲的枝條剪短，放在塑料杯或者尼龍袋中飼養(yǎng)；每天觀察出蜂情況，發(fā)現(xiàn)有羽化的寄生蜂即用毛刷將其收集于塑料管中，用無水乙醇浸泡殺死，-4 ℃存放。在體視鏡下檢視收集到的標(biāo)本，參考文獻(xiàn)(徐志宏，黃建，2004；Zhang & Huang，2004；Wangetal.，2014)進(jìn)行初步形態(tài)分類并通過專家的復(fù)核。每個(gè)形態(tài)種選取一定的樣本用于分子研究，并對(duì)所選樣本拍照，便于后期進(jìn)一步核對(duì)。材料樣本信息見表1。

1.2 基因組總DNA的提取

先用蒸餾水沖洗選取的跳小蜂蟲體，放于濾紙上，晾干后使用試劑盒(Qiagene Tissue DNA Kit)提取各樣品的DNA，過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。將合格的DNA樣品放入4 ℃?zhèn)溆茫?20 ℃長期保存。

1.3 PCR擴(kuò)增

目的線粒體COⅠ基因片段擴(kuò)增選用的引物對(duì)參考Zhang等(2011)。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：5 μL 10×buffer PCR緩沖液，25 mM MgCl2，5 mM dNTP混合液，0.5 U TaqDNA聚合酶，正反向引物各10 pmol和5 μL DNA模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后的產(chǎn)物送測序公司用ABI3730測序儀雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

獲得的線粒體COⅠ基因片段與GenBank下載的COⅠ基因序列經(jīng)Clustal W(Thompsonetal.，1994)比對(duì)后用BioEdit 7.0.5(Hall，1999)進(jìn)一步編輯，使用MEGA4(Tamuraetal.，2007)分析各序列的堿基組成、保守位點(diǎn)、變異位點(diǎn)、轉(zhuǎn)換與顛換的比值(R)等。選取刷盾跳小蜂Encyrtussp.為外群，采用鄰接法(NJ法)構(gòu)建基因樹(K2P模型)，并計(jì)算種間和種內(nèi)遺傳距離。另外使用BarcodingR(Zhangetal.，2017)對(duì)寄生紫薇絨蚧的跳小蜂以及闊柄跳小蜂屬M(fèi)etaphycus屬內(nèi)種間和種內(nèi)遺傳距離的間隔進(jìn)行分析評(píng)估。

表1 跳小蜂樣品采集信息Table 1 Sampling information of encyrtids

續(xù)表1編號(hào)Code形態(tài)種名Species地點(diǎn)Locality時(shí)間Collecting date寄主植物Host plantGenBank登錄號(hào)GenBankaccession No.09-010A絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939109-010B絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939209-010C絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939309-010D絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939409-010E絨蚧花翅跳小蜂Microterys spE江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH119395E2-046A絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci北京海淀2012/07/17紫薇Lagerstroemia indicaMH119396E2-046B絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci北京海淀2012/07/17紫薇Lagerstroemia indicaMH11939710-117絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939810-118A絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH11939910-118B絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci江蘇南京2009/10/12紫薇Lagerstroemia indicaMH119400E3-002A絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119406E3-002B絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119407E3-002C絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci云南文山2013/04/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119408E4-123A絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119401E4-123B絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119402E4-123C絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119403E4-123D絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH119404E4-123E絨蚧皂莫跳小蜂Zaomma eriococci湖北黃岡2014/06/22紫薇Lagerstroemia indicaMH11940511-092水木堅(jiān)蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae北京海淀2014/06/20糖槭Acer saccharumMH119409E2-030B水木堅(jiān)蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龍江哈爾濱2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119410E2-030C水木堅(jiān)蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龍江哈爾濱2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119411E2-030D水木堅(jiān)蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龍江哈爾濱2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119412E2-030E水木堅(jiān)蚧闊柄跳小蜂Metaphycus corni-ae黑龍江哈爾濱2012/06/10糖槭Acer saccharumMH119413E1-190A加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon內(nèi)蒙古賀蘭山2010/08/10未知UnknownMH119414E1-190B加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon內(nèi)蒙古賀蘭山2010/08/10未知UnknownMH119415E1-190C加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon內(nèi)蒙古賀蘭山2010/08/10未知UnknownMH119416E1-190D加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon內(nèi)蒙古賀蘭山2010/08/10未知UnknownMH119417E2-122A加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119418E2-122B加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119419E2-122C加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119420E2-122D加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119421E2-122E加蒙闊柄跳小蜂Metaphycus garmon北京昌平2009/04/25未知UnknownMH119422E2-097杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi云南景洪2012/05/14未知UnknownMH119423E2-189杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi四川攀枝花2009/04/25榕樹Figus sp.MH119424E5-117A杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi廣西宜州2009/04/25假連翹Duranta repensMH119425E5-117C杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi廣西宜州2009/04/25假連翹Duranta repensMH119426E5-117D杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi廣西宜州2009/04/25假連翹Duranta repensMH119427E5-117E杰氏闊柄跳小蜂Metaphycus gerardi廣西宜州2009/04/25假連翹Duranta repensMH11942808-58亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens山西五臺(tái)山2007/07/18未知UnknownMH11942910-007亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens山西五臺(tái)山2009/07/20未知UnknownMH11943010-173A亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens寧夏銀川2010/07/06未知UnknownMH11943110-173B亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens寧夏銀川2010/07/06未知UnknownMH11943210-173C亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens寧夏銀川2010/07/06未知UnknownMH119433E1-222A亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens內(nèi)蒙古賀蘭山2010/08/11未知UnknownMH119434E1-222B亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens內(nèi)蒙古賀蘭山2010/08/11未知UnknownMH119435E1-222C亮光闊柄跳小蜂Metaphycus nitens內(nèi)蒙古賀蘭山2010/08/11未知UnknownMH11943607_04刷盾跳小蜂(外群)Encyrtus sp. (outgroup)海南五指山2007/05/15未知 UnknownMH119344

2 結(jié)果和分析

外部形態(tài)特征分類結(jié)果顯示，本次收集的寄生紫薇絨蚧的跳小蜂為絨蚧闊柄跳小蜂、細(xì)柄闊柄跳小蜂Metaphycuscylindricus、絨蚧花翅跳小蜂MicroterysspE和絨蚧皂莫跳小蜂Zaommaeriococci。闊柄跳小蜂屬內(nèi)其他非寄生紫薇絨蚧的種類分別為水木堅(jiān)蚧闊柄跳小蜂Metaphycuscorniae、加蒙闊柄跳小蜂Metaphycusgarmon、杰氏闊柄跳小蜂Metaphycusgerardi和亮光闊柄跳小蜂Metaphycusnitens。

2.1 COⅠ基因片段序列堿基組成

本研究共獲取了93個(gè)跳小蜂樣本的線粒體COⅠ基因片段序列(GenBank登錄號(hào)：MH119344～MH119436)，其中，絨蚧闊柄跳小蜂29條、細(xì)柄闊柄跳小蜂14條、絨蚧花翅跳小蜂8條、絨蚧皂莫跳小蜂13條、水木堅(jiān)蚧闊柄跳小蜂5條、加蒙闊柄跳小蜂9條、杰氏闊柄跳小蜂6條、亮光闊柄跳小蜂 8條、刷盾跳小蜂1條。另外，從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取黃色闊柄跳小蜂Metaphycusflavus序列1條(GenBank登錄號(hào)：FM210164)(Pasqueretal.，2009)。截取COⅠ基因序列兩端不可靠的堿基后得到長度為612 bp的堿基矩陣。MEGA4分析結(jié)果顯示，在線粒體COⅠ條形碼區(qū)域中，A與T的含量非常高(A=28.8%，C=12.4%，G=15.1%，T=43.6%)。GC含量在密碼子第三位點(diǎn)平均為8.7%，明顯低于第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)(平均為34.4%和39.4%)。共檢測到391個(gè)保守位點(diǎn)，221個(gè)變異位點(diǎn)，R=0.87。

2.2 分子系統(tǒng)樹分析

以刷盾跳小蜂為外群，基于94條跳小蜂線粒體COⅠ基因序列數(shù)據(jù)矩陣構(gòu)建NJ樹，結(jié)果(圖1)顯示，內(nèi)群93條跳小蜂COⅠ基因序列聚成9個(gè)大的分支，并且除黃色闊柄跳小蜂序列少無法統(tǒng)計(jì)支持率外，其他每個(gè)分支都有>95%的支持率。這9個(gè)分支分別對(duì)應(yīng)9個(gè)形態(tài)種，其中，闊柄跳小蜂屬為單系群。此外，絨蚧闊柄跳小蜂分成了2個(gè)較為明顯的分支，表明該種內(nèi)部存在較明顯的分化。

2.3 種間和種內(nèi)的遺傳距離

應(yīng)用MEGA4計(jì)算9種跳小蜂線粒體COⅠ基因序列的種內(nèi)與種間遺傳距離。結(jié)果顯示(表2)，絨蚧闊柄跳小蜂的種內(nèi)遺傳距離最大，為0～0.054 9，平均為0.026 5；細(xì)柄闊柄跳小蜂和絨蚧皂莫跳小蜂的種內(nèi)平均遺傳距離次之，分別為0.014 7和0.010 4。跳小蜂各種間平均遺傳距離為0.073 2～0.186 4(表3)，其中，絨蚧花翅跳小蜂和絨蚧皂莫跳小蜂的種間平均遺傳距離最大，為0.186 4；細(xì)柄闊柄跳小蜂和黃色闊柄跳小蜂的種間平均遺傳距離最小，為0.073 2。對(duì)NJ樹上絨蚧闊柄跳小蜂2個(gè)較明顯的分支進(jìn)行遺傳距離分析顯示，它們之間的平均遺傳距離為0.041 8，分支內(nèi)平均遺傳距離分別為0.018 6(分支1)和0.003 7(分支2)。本研究中 9種跳小蜂線粒體COⅠ基因序列的種內(nèi)與種間遺傳距離顯示，各跳小蜂的種內(nèi)遺傳距離與種間遺傳距離間沒有重疊區(qū)域，即種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離之間有間隔(圖2)。

表2 9種跳小蜂的種內(nèi)平均遺傳距離Table 2 Intra-species genetic distance of encyrtids

圖1 基于跳小蜂COⅠ基因序列構(gòu)建的鄰接樹Fig. 1 Neighbour-Joining tree based on the COⅠ sequences of encyrtids

注 Notes： 1. 細(xì)柄闊柄跳小蜂Metaphycuscylindricus， 2. 絨蚧闊柄跳小蜂Metaphycuseriococci， 3. 絨蚧花翅跳小蜂MicroterysspE， 4. 絨蚧皂莫跳小蜂Zaommaeriococci， 5. 水木堅(jiān)蚧闊柄跳小蜂Metaphycuscorniae， 6. 黃色闊柄跳小蜂Metaphycusflavus， 7. 加蒙闊柄跳小蜂Metaphycusgarmon， 8. 杰氏闊柄跳小蜂Metaphycusgerardi， 9. 亮光闊柄跳小蜂Metaphycusnitens

圖2 9種跳小蜂COⅠ基因序列的種內(nèi)與種間遺傳距離的分布頻率(K2P模型)Fig. 2 Frequency distribution of the intra- and inter-species genetic distances of 9 encyrtid species based on COⅠ sequences (K2P model)

3 討論

本研究利用DNA條形碼技術(shù)鑒別了我國9種跳小蜂，其種間遺傳距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)遺傳距離，且兩者沒有重疊，表明DNA條形碼技術(shù)能區(qū)別我國寄生紫薇絨蚧的跳小蜂種類。研究結(jié)果顯示，屬間的遺傳距離大于屬內(nèi)不同種間，并且NJ樹顯示寄生紫薇絨蚧的幾種跳小蜂各聚類成單系群，表明DNA條形碼能夠區(qū)分這9種跳小蜂。這與之前關(guān)于利用DNA條形碼鑒別跳小蜂種類的研究結(jié)論(Zhangetal.，2011；Chestersetal.，2012)一致。

本研究中，闊柄跳小蜂屬的種類屬于同一個(gè)種團(tuán)，親緣關(guān)系相近，形態(tài)差別很小(Wangetal.，2014)。但是DNA條形碼分析結(jié)果顯示，它們之間的遺傳距離遠(yuǎn)大于目前DNA條形碼研究中通用的分種標(biāo)準(zhǔn)(遺傳距離>4%)。這表明DNA條形碼技術(shù)對(duì)同屬的跳小蜂近緣種具有很好的識(shí)別效果。另外，DNA條形碼技術(shù)也有助于了解物種內(nèi)的分子變異程度。研究結(jié)果顯示，絨蚧闊柄跳小蜂的COⅠ基因序列聚成2個(gè)分支，并且2個(gè)分支間的平均遺傳距離較大。但是觀察這2個(gè)分支上的樣本，其外部形態(tài)幾乎沒有差別或差別極小，在地理分布上，這2個(gè)分支上的樣本明顯重疊，這種遺傳結(jié)構(gòu)形成的機(jī)制或是否存在隱存種需要進(jìn)一步研究。

跳小蜂種類較多，寄生關(guān)系比較復(fù)雜，且對(duì)于我國跳小蜂種類和寄生關(guān)系也缺乏系統(tǒng)深入的調(diào)查。本研究使用的跳小蜂種類有限，特別是同屬種類較少，因此，基于COⅠ基因計(jì)算跳小蜂的種內(nèi)和種間遺傳距離是否存在間隔還有待進(jìn)一步研究。本研究中9種跳小蜂的種內(nèi)和種間遺傳距離不存在重疊，且進(jìn)化樹上各形態(tài)種形成單系，表明了DNA條形碼技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地鑒別這幾種寄生紫薇絨蚧跳小蜂。隨著未來其他寄生蜂種類COⅠ基因序列信息的不斷補(bǔ)充與完善，DNA條形碼技術(shù)必將對(duì)研究我國蚧蟲寄生蜂的物種識(shí)別、闡明寄生蜂對(duì)寄主的?；砸?guī)律和利用寄生蜂開展有效的生物防治產(chǎn)生積極的推動(dòng)作用。