灰樹花多糖對TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞炎癥因子分泌的影響

杜一峰 鄭 浩 劉 進 李 藝 雷 萍 侯殿東

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種常見的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病。近30年來AD的發(fā)病率在全球呈明顯上升趨勢，在發(fā)達國家可累及10%～20%的兒童及1%～3%的成人，污染嚴重的國家尤為明顯[1]。近年來隨著我國城市化，工業(yè)化進程的加速，環(huán)境污染日益加重，AD在我國的發(fā)病率亦呈現(xiàn)快速上升趨勢[2]。局部外用糖皮質激素，并配合應用潤膚保濕劑是目前AD的一線療法，但長期應用糖皮質激素副作用大，患者不易耐受[3,4]。AD作為嚴重影響人類健康，尤其是兒童身心健康發(fā)展的疾病，日益受到世界各國的廣泛關注。因此，尋找有效的治療方法具有重要的公共衛(wèi)生意義?；覙浠?Grifola frondosa)屬擔子菌綱多孔菌科，是一種藥食兩用珍稀食用菌，其含有眾多活性物質，灰樹花多糖(Grifola frondosa Polysaccharide, GFP)是灰樹花最主要的一類活性成分[5]。已有研究表明，GFP可明顯抑制AD小鼠皮損部位的炎癥反應，并且對Th1/Th2平衡也具有調節(jié)作用[6]，但其進一步機制并不明確。本實驗采用TNF-α與IFN-γ誘導活化的HaCaT細胞為AD體外模型，通過研究GFP對TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞炎癥因子產(chǎn)生的影響及對NF-κB信號通路的影響，深入揭示GFP對AD炎癥抑制的作用機制，為GFP治療AD提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 GFP(純度>70%)購自南京廣潤生物制品有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自GIBCO公司，胎牛血清購自HyClone公司，TNF-α和IFN-γ均購自Sigma公司，RNA提取、逆轉錄、qPCR擴增試劑盒及引物均購自Promega公司，TARC、MDC ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，anti-NF-κB、anti-磷酸化(p)-NF-κB 蘇州睿瀛生物技術有限公司，HRP標記羊抗兔IgG Proteintech，ECL發(fā)光試劑盒Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人角質形成細胞系(HaCaT細胞) 購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。該細胞系用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基在37℃，5% CO2條件下恒溫貼壁培養(yǎng)。

1.2.2 實驗共分5組 A組為正常對照組，B組為TNF-α/IFN-γ活化組，C、D、E組分別為GFP低、中、高劑量干預組。將HaCaT細胞接種于六孔板中，106/孔， 37℃、5% CO2條件下過夜培養(yǎng)，細胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入不含血清DMEM培養(yǎng)基2 mL，TNF-α/IFN-γ活化組和GFP干預組細胞加入IFN-γ和TNF-α，終濃度均為10 ng/mL ，對照組加入等量PBS。GFP干預組細胞加入不同濃度的GFP工作液(GFP溶于PBS)，使其終濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL和0.8 mg/mL。對照組和模型組加入等量PBS，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液和細胞。

1.2.3 qPCR法檢測TARC、MDC、IL-6 和TNF-α mRNA表達Trizol法提取總RNA后參照說明書進行反轉錄，然后進行qPCR。引物序列見表1。qPCR方法如下：以1 μL cDNA為模板，GAPDH為內參，采用ABI 7500 Real time PCR系統(tǒng)進行擴增。PCR反應條件：變性95℃、30 s；變性95℃、5 s，退火延伸60℃、30 s，40個循環(huán)。每個樣品做3個復孔，反應結束后確認擴增曲線及熔解曲線，取Ct值的平均值，再用公式2-ΔΔCt計算各基因的相對表達量。

1.2.4 ELISA檢測TARC和MDC分離細胞培養(yǎng)上清液，80℃保存待測。按試劑盒說明書操作檢測其含量。

1.2.5 NF-κB和p-NF-κB蛋白表達的檢測細胞裂解液裂解細胞，超聲處理10 s，12000×g離心5 min，取上清液BCA法檢測蛋白濃度。取25 μg蛋白經(jīng)10%SDS PAGE電泳分離蛋白，將目的蛋白轉移至硝酸纖維素濾膜上，在5%脫脂奶粉的封閉液中室溫下封閉2 h，分別加入NF-κB和p-NF-κB一抗4℃過夜，洗膜后，加入二抗，37℃，l h。ECL發(fā)光，信號在圖像分析系統(tǒng)中進行吸光度掃描。以β-actin作為內參，獲得蛋白相對量。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 以上檢測每一濃度的藥物設3個平行復孔，重復實驗三次。所得實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，各組間均數(shù)比較采用一維方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。

表1 qPCR引物序列

2 結果

2.1 GFP對TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞TARC、MDC、IL-6 和TNF-α mRNA表達的影響從圖1可見，與正常對照組細胞相比，TNF-α和IFN-γ可顯著上調HaCaT細胞TARC、MDC、IL-6 和TNF-α mRNA的表達；與TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞相比，GFP可顯著下調TARC、MDC、IL-6和TNF-α mRNA的表達。

2.2 GFP對TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞TARC、MDC表達的影響從圖2可見，與正常對照組細胞相比，TNF-α和IFN-γ可顯著促進HaCaT細胞TARC和MDC的表達；與TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞相比，GFP可顯著抑制TARC和MDC的表達。

2.3 GFP對TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞NF-κB和p-NF-κB表達的影響從圖3可見，與正常對照組細胞相比，TNF-α和IFN-γ及GFP對NF-κB表達無明顯影響。與正常對照組細胞相比，TNF-α和IFN-γ可顯著上調HaCaT細胞p-NF-κB的表達；與TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞相比，GFP可顯著下調p-NF-κB的表達。

a：IL-6;b：MDC；c：TARC；d：TNF-α。**：與對照組相比，P<0.01；##與TNF-α/IFN-γ誘導細胞相比，P<0.01；#與TNF-α/IFN-γ誘導細胞相比，P<0.05

a：MDC;b：TARC。**：與對照組相比，P<0.01；##與TNF-α/IFN-γ誘導細胞相比，P<0.01

**：與對照組相比，P<0.01；##與TNF-α/IFN-γ誘導細胞相比，P<0.01

3 討論

本研究采用INF-γ和TNF-α刺激HaCaT細胞以制備細胞炎癥模型，在此基礎上加入GFP干預，研究GFP的抗炎作用及機制。結果表明，GFP對TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞胸腺活化調節(jié)趨化因子(thymus and activation regulated chemokine, TARC/CCL17)和巨噬細胞源趨化因子(macrophage derived chemokine，MDC/CCL22)、IL-6和TNF-α mRNA及TARC、MDC蛋白的表達均有明顯抑制作用(P<0.05)。

在AD發(fā)病過程中，Th2細胞過度活化，分泌大量Th2型細胞因子[7]。過度表達的Th2型細胞因子使AD患者表皮絲聚合蛋白(filaggrin,FLG)表達下降[8]。FLG的減少和缺失，可能是引起AD等干燥性皮膚病的主要原因[9]。因此，拮抗Th2型細胞因子、調節(jié)Th1/Th2平衡是修復皮膚屏障功能的策略之一。TARC和MDC為Th2細胞的趨化因子，二者均可與Th2細胞表面CCR4結合，將Th2細胞募集至炎癥部位[10]。AD患者血清TARC和MDC水平顯著升高，這兩個指標與疾病嚴重程度密切相關[11]。IL-6屬于Th2型細胞因子，作為前炎癥細胞因子，IL-6在炎癥反應過程中起著重要的作用[12]。AD患者血清IL-6水平較正常人明顯升高[13]。AD患者體內Th2細胞不但能夠產(chǎn)生經(jīng)典的Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-13，還可產(chǎn)生TNF-α，形成“炎癥性Th2”反應[14]。

研究表明AD皮損部位TARC、MDC等Th2型細胞因子的產(chǎn)生與NF-κB信號途徑有關[15]。核因子κB(nuclear factor -kappa B, NF-κB)可以被多種刺激劑，如TNF-α等激活。激活的NF-κB與IκB解離后轉位入核與靶基因啟動子/增強子上的κB位點結合，從而調節(jié)許多靶基因的表達[16]。結果表明與TNF-α/IFN-γ誘導的HaCaT細胞相比，GFP可顯著下調p-NF-κB的表達。這表明GFP的抗炎作用可能與其抑制NF-κB P65信號通路的活化有關。

本研究結果表明GFP具有明顯的抗炎作用，其機制可能與調節(jié)NF-κB P65信號通路有關。通過研究GFP對在炎癥性皮膚病中的作用機制，可以為GFP在臨床中應用提供實驗依據(jù)。