不同氮源對(duì)一株溶藻弧菌好氧反硝化效率的影響

劉興，薄香蘭，陳繼楚，李連星，朱會(huì)杰，王軍，周文禮，陳成勛

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384；2.天津立達(dá)海水資源開(kāi)發(fā)有限公司，天津 300280)

生物脫氮是去除養(yǎng)殖水體中氮污染的有效方法之一，具有經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)且不會(huì)對(duì)養(yǎng)殖水體造成二次污染[1]。通常認(rèn)為，生物脫氮包括好氧硝化和厭氧反硝化兩個(gè)過(guò)程，反硝化只有在厭氧條件下才會(huì)發(fā)生，20世紀(jì)80年代，隨著副球菌屬Paracoccus的首次發(fā)現(xiàn)[2]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)好氧反硝化細(xì)菌研究報(bào)道逐漸增多，主要包括假單胞菌屬Pseudomonas[3]、產(chǎn)堿菌屬Alcaligenes[4]、芽孢桿菌屬Bacillus[5]等。在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，通常為保證養(yǎng)殖動(dòng)物健康生長(zhǎng)，養(yǎng)殖水體必須保證在高溶氧狀態(tài)下，而厭氧反硝化脫氮效率就會(huì)因此嚴(yán)重降低，故研究好氧反硝化細(xì)菌勢(shì)在必行[6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)菌株篩選自天津市某水產(chǎn)公司海水工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖池。

1.1.2 培養(yǎng)基 維氏鹽溶液：將5.0 g K2HPO4、2.5 g MgSO4·7H2O、0.05 g FeSO4·7H2O、0.05 g MnSO4·4H2O依次溶于1 L鹽度為15的海水中。

銨態(tài)氮源培養(yǎng)基：將0.5 g NH4Cl、5.66 g 檸檬酸鈉、50 mL 維氏鹽溶液依次溶于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7。培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)121 ℃滅菌20 min，下同。

硝態(tài)氮源培養(yǎng)基：將0.8 g NaNO3、5.66 g 檸檬酸鈉、50 mL 維氏鹽溶液依次溶于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7。

亞硝態(tài)氮源培養(yǎng)基：將0.65 g NaNO2、5.66 g 檸檬酸鈉、50 mL 維氏鹽溶液依次溶于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7。

對(duì)照組為生理鹽水，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 麥?zhǔn)蠞舛葍x(DENSICHEK，IDK215957)；紫外分光光度計(jì)(UVmini-1240)、一氧化氮檢測(cè)儀(深圳市普利通電子科技有限公司，PLT-BX-NO)；一氧化二氮檢測(cè)儀(深圳市普利通電子科技有限公司，PLT-BX-N2O)；氮?dú)鈾z測(cè)儀(深圳市普利通電子科技有限公司，PLT-BX-N2)；pH計(jì)(SevenEasy Plus-S20P)。

1.2 方法

在容積為10 L的發(fā)酵罐中進(jìn)行試驗(yàn)(圖1)，試驗(yàn)前將所有裝置在121 ℃下滅菌處理20 min， 將7 L不同氮源的硝化培養(yǎng)基分別加入不同發(fā)酵罐中，各記為A(銨態(tài)氮源培養(yǎng)基)、B(硝態(tài)氮源培養(yǎng)基)、C(亞硝態(tài)氮源培養(yǎng)基)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，各試驗(yàn)組接種10 mL濃度為2.93麥?zhǔn)蠞舛鹊娜茉寤【鶫A2，試驗(yàn)溫度為(26.03±1.16)℃，連續(xù)發(fā)酵120 h，在發(fā)酵的第0、12、18、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、84、96、108、120 h 取樣。發(fā)酵液每次取10 mL,分別以5000 r/min離心10 min，測(cè)定上清液中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的濃度，檢測(cè)發(fā)酵罐中N2、NO、N2O氣體的含量，直到儀器顯示濃度達(dá)到穩(wěn)定值為止。

圖1 試驗(yàn)裝置Fig.1 A diagram of the apparatus used in the experiment

本試驗(yàn)中，分別采用納氏試劑分光光度法、鋅-鎘還原分光光度法、重氮-偶氮光度法、麥?zhǔn)蠞舛葍x，檢測(cè)銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、菌液濃度；通過(guò)深圳市普利通電子科技有限公司的電子儀器檢測(cè)N2、NO、N2O氣體的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行非線性回歸分析，根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)濃度、時(shí)間計(jì)算出3種培養(yǎng)基條件下非線性參數(shù)，再根據(jù)擬合曲線參數(shù)值、估計(jì)值、擬合度(R2)選出最優(yōu)生長(zhǎng)模型，模型表達(dá)式為指數(shù)函數(shù)y=k/[1+exp(a-b×t)]，其中a為參數(shù)，b為瞬時(shí)生長(zhǎng)率，k為生長(zhǎng)極限值，t為自變量時(shí)間(h)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶藻弧菌HA2在3種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況

根據(jù)各時(shí)期不同培養(yǎng)基中溶藻弧菌HA2測(cè)定的麥?zhǔn)蠞舛葦?shù)據(jù)，用Logistic非線性模型對(duì)溶藻弧菌HA2的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合。在銨態(tài)氮源培養(yǎng)基中，HA2的生長(zhǎng)曲線通過(guò)多次調(diào)整擬合(圖2)，確定最高擬合度R2為0.791，擬合程度一般，生長(zhǎng)極限k值為4.769，實(shí)際平均值比擬合值稍早到達(dá)生長(zhǎng)極限k，試驗(yàn)第66 h時(shí)達(dá)到k值；在硝態(tài)氮源培養(yǎng)基中，HA2的生長(zhǎng)曲線擬合見(jiàn)圖3，擬合度R2為0.917，擬合曲線與實(shí)際平均值基本上吻合，生長(zhǎng)極限k值為5.477，在試驗(yàn)第84 h 時(shí)達(dá)到k值；在亞硝態(tài)氮源培養(yǎng)基中，HA2的生長(zhǎng)曲線擬合見(jiàn)圖4，擬合度R2為0.977，擬合程度較高，擬合曲線與實(shí)際平均值基本吻合，生長(zhǎng)極限k值為5.567，試驗(yàn)第108 h 時(shí)達(dá)到k值。 在銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮3種氮源培養(yǎng)基中溶藻弧菌HA2的生長(zhǎng)擬合曲線均呈“S”型，經(jīng)擬合曲線結(jié)果可得瞬時(shí)生長(zhǎng)速率參數(shù)b依次減小(0.910、0.891、0.887)，擬合度R2依次增加，HA2菌生長(zhǎng)極限k值依次升高。

圖2 溶藻弧菌HA2在銨態(tài)氮源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)擬合曲線Fig.2 Growth curve of Vibrio alginolyticus HA2 in the ammonium nitrogen culture media

2.2 溶藻弧菌HA2在不同氮源培養(yǎng)基中對(duì)代謝的影響

圖3 溶藻弧菌HA2在硝態(tài)氮源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)擬合曲線Fig.3 Growth curve of Vibrio alginolyticus HA2 in nitrate nitrogen culture media

圖4 溶藻弧菌HA2在亞硝態(tài)氮源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)擬合曲線Fig.4 Growth curve of Vibrio alginolyticus HA2 in nitrite nitrogen culture media

圖5 銨態(tài)氮源培養(yǎng)基中銨態(tài)氮、硝酸態(tài)氮、亞硝酸態(tài)氮含量變化Fig.5 Changes in concentrations of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in ammonium nitrogen culture media

圖6 硝態(tài)氮源培養(yǎng)基中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量的變化Fig.6 Changes in concentrations of ammonia nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen in nitrate nitrogen culture media

注：該次測(cè)定缺少硝態(tài)氮數(shù)據(jù)。硝態(tài)氮測(cè)定原理是通過(guò)硝態(tài)氮硝解還原為亞硝態(tài)氮，再進(jìn)行亞硝態(tài)測(cè)定Note：The nitrate nitrogen data are absent because the reduction rate can not be accurately measured. The determination of nitrate nitrogen levle is based on nitrate-N reduction to nitrite nitrogen and then nitrite determination圖7 亞硝態(tài)氮源培養(yǎng)基中銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量變化Fig.7 Changes in concentrations of ammonia nitrogen and nitrate nitrogen in nitrite nitrogen culture media

2.3 不同氮源培養(yǎng)基中代謝氣體的含量

本試驗(yàn)中利用3種不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)溶藻弧菌HA2，試驗(yàn)過(guò)程中均未檢測(cè)出NO、N2O (儀器測(cè)定范圍0～50 mg/L，分辨率為0.5 mg/L)。在不同培養(yǎng)基中N2的代謝狀況見(jiàn)圖8，各組N2量與對(duì)照組相比均有增加趨勢(shì)。銨態(tài)氮組0～18 h時(shí)，N2量緩慢增加，51 h 時(shí)達(dá)到最高(80.38%)，在第60 h時(shí)又有降低趨勢(shì)，N2量最低為79.37%，最高達(dá)到80.39%；第51 h時(shí)硝態(tài)氮培養(yǎng)基中N2量達(dá)到最高(80.45%)；第51 h時(shí)亞硝態(tài)氮培養(yǎng)基中N2量達(dá)到最高(80.53%)。從N2量趨勢(shì)圖可看出，3種氮源培養(yǎng)基同時(shí)在51 h時(shí)上升到最高點(diǎn)， N2量在銨態(tài)氮培養(yǎng)基中上升最早，在亞硝態(tài)氮培養(yǎng)基中上升最晚，但在亞硝態(tài)氮培養(yǎng)基上升速率最快。

圖8 在不同培養(yǎng)基中溶藻弧菌HA2產(chǎn)生的N2量Fig.8 N2 levels produced by Vibrio alginolyticus HA2 in different culture media

2.4 不同氮源培養(yǎng)基中pH的變化

溶藻弧菌HA2在不同氮源培養(yǎng)基中pH變化如圖9所示，各組培養(yǎng)基pH均呈增加趨勢(shì)，在加入培養(yǎng)基的第24 h時(shí)，pH值開(kāi)始上升，銨態(tài)氮組上升速率最快，硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮組上升速率趨于一致。培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮組pH值分別為7.88、8.45和8.54，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，各組的pH分別為9.46、9.54和9.51。

圖9 溶藻弧菌HA2在各培養(yǎng)基中pH的變化Fig.9 Changes in pH of Vibrio alginolyticus HA2 in the culture media

3 討論

3.1 溶藻弧菌HA2在不同氮源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)

本研究中對(duì)溶藻弧菌HA2菌株在3種氮源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)進(jìn)行Logistic模型曲線擬合，擬合曲線均呈“S”型，擬合曲線與實(shí)際平均值基本吻合。

同步硝化反硝化細(xì)菌在不同氮源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況有較大差異，梁賢[8]研究發(fā)現(xiàn)，異氧硝化細(xì)菌YL分別在以唯一氮源為亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況均較好。潘玉瑾等[9]研究發(fā)現(xiàn)，好氧反硝化細(xì)菌ZPQ2分別在以KNO3、(NH4)2SO4為唯一氮源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好。本試驗(yàn)中分別以銨態(tài)氮(NH4Cl)、硝態(tài)氮(NaNO3)、亞硝態(tài)氮(NaNO2)為唯一氮源培養(yǎng)溶藻弧菌HA2，并擬合該菌株生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，溶藻弧菌HA2在銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)3種氮源培養(yǎng)基中達(dá)到生長(zhǎng)極限k值分別需要66、84、108 h，擬合曲線瞬時(shí)生長(zhǎng)速率參數(shù)b分別為0.910、0.891、0.887，由此可知，該菌株在3種氮源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率從快到慢分別為銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮。Logistic擬合模型本質(zhì)是反映生物遺傳生長(zhǎng)潛力，不受環(huán)境、食物等因素影響，只與生物品種有關(guān)[10]。事實(shí)上，溶藻弧菌HA2生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)受到氮源等因素的影響，從而影響擬合曲線的擬合度，擬合度大小反映氮源對(duì)該菌株生長(zhǎng)影響程度，生長(zhǎng)極限k值是細(xì)菌在該環(huán)境中所能達(dá)到的極限值，k值受不同種類氮源影響。本試驗(yàn)中，溶藻弧菌HA2在銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮3種不同氮源培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線擬合度R2分別為0.791、0.917、0.977，生長(zhǎng)極限k值分別為4.769、5.477、5.567，因此，該菌株受3種培養(yǎng)基的影響程度依次為亞硝態(tài)氮<硝態(tài)氮<銨態(tài)氮。本試驗(yàn)結(jié)果表明，溶藻弧菌HA2在這3種氮源培養(yǎng)基中均可以生長(zhǎng)，這與楊浩鋒等[11]、王弘宇等[12]、Ellington等[13]的研究結(jié)果一致。

3.2 溶藻弧菌HA2在不同氮源培養(yǎng)基中對(duì)代謝的影響

(ΔG°′=-274.7 kJ/mol)，

(1)

(2)

(ΔG°′=-348.9 kJ/mol)。

(3)

3.3 溶藻弧菌HA2在不同氮源培養(yǎng)基中的代謝氣體分析

3.4 溶藻弧菌HA2在不同氮源培養(yǎng)基中對(duì)pH的影響

4 結(jié)論

致謝：感謝天津立達(dá)海水資源開(kāi)發(fā)有限公司為本試驗(yàn)提供幫助！