谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉肌肉成分、氨基酸組成及AKP活性的影響

趙志剛，宋芳杰、2，王連生，羅亮，王常安，李晉南，都雪，徐奇友

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無錫 214182)

谷氨酰胺(glutamine, Gln)是動物體內(nèi)含量最豐富的游離態(tài)氨基酸，在機體內(nèi)參與多種代謝物質(zhì)的合成，也是體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的重要來源[1-3]。通常動物機體內(nèi) Gln 可以內(nèi)源合成或通過外源添加獲得，但當(dāng)機體處于病理或應(yīng)激狀態(tài)時，內(nèi)源性Gln的合成量較少，通常遠不能滿足動物機體的正常需求，此時動物機體內(nèi) 的Gln含量 相對缺乏[4]。研究顯示，在飼料中添加外源性Gln 能夠改善魚體腸道結(jié)構(gòu)和功能，促進腸道發(fā)育[5-6]。然而，外源性 Gln 極不穩(wěn)定，受熱后容易分解生成有毒物質(zhì)[7]。鑒于此，不同學(xué)者對其相關(guān)替代物進行了深入研究[8-9]。李晉南等[10-11]的研究表明，飼料中添加α-酮戊二酸(AKG)、L-鳥氨酸-α-酮戊二酸(OKG)、谷氨酸(Glu)可顯著影響魚體腸道的消化酶活性及腸道發(fā)育。從代謝角度分析，Gln 的前體物，如AKG、Glu、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)、OKG、α-酮戊二酸鈉(2Na-AKG)等均可在動物機體中與Gln發(fā)揮相同或相似的功能。

松浦鏡鯉CyprinuscarpioSongpu作為黑龍江水產(chǎn)研究所成功選育的經(jīng)濟新品種，因其較好的體型優(yōu)勢和經(jīng)濟性狀，在全國范圍內(nèi)已被廣泛推廣[12]。本試驗中，以 Gln 的代表性前體物AKG、AAKG、Glu、OKG和 2Na-AKG作為添加劑，研究了Gln前體物對鏡鯉肌肉成分、氨基酸組成和堿性磷酸酶(AKP)活性的影響，旨在為松浦鏡鯉飼料的科學(xué)配制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗魚為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所培育。選擇3000尾規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的松浦鏡鯉，在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)并馴化1周。暫養(yǎng)期間，每日7:30、12:30、16:30飽食飼喂基礎(chǔ)飼料，每天換水20%，水溫維持在(25.0±2.0)℃，溶解氧大于5.0 mg/L。

α-酮戊二酸(AKG)購自Sigma公司，谷氨酰胺(Gln)、L-鳥氨酸-α-酮戊二酸(OKG)(AKG與L-鳥氨酸質(zhì)量比為1∶1)、谷氨酸(Glu)、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)(AKG與L-精氨酸質(zhì)量比為1∶2)和α-酮戊二酸鈉(2Na-AKG)均購自鼓臣生物技術(shù)有限公司(上海)，各物質(zhì)純度均≥98.0%。

1.2 方法

1.2.1 試驗飼料的制備 以魚粉和豆粕作為蛋白源，魚油、豆油和磷脂作為脂肪源，根據(jù)NRC(2011)[13]及SC/T1026-2002《鯉魚配合飼料》[14]要求配制基礎(chǔ)飼料。分別用Gln、Glu、AKG、OKG、AAKG、2Na-AKG替代基礎(chǔ)飼料中1.5%的葡萄糖，制成6種等能等氮飼料?；A(chǔ)飼料的組成及營養(yǎng)水平見表1。將飼料原料粉碎、稱重、逐級混合均勻后，制成顆粒飼料(粒徑為2 mm)，在常溫條件下風(fēng)干，于冰箱(4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試驗設(shè)計及管理 馴化結(jié)束后，挑選松浦鏡鯉1050尾(體質(zhì)量為40.27 g±3.96 g)隨機分為7組，每組設(shè)5個重復(fù)，每個重復(fù)放養(yǎng)試驗魚30尾。各處理組均隨機飼喂一種試驗飼料，空白對照組投喂基礎(chǔ)飼料。試驗魚在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)內(nèi)養(yǎng)殖(魚缸高0.6 m、直徑1.2 m)，每天7:30、12:30、16:30飽食投喂3次。養(yǎng)殖期間，系統(tǒng)內(nèi)每天換水20%，水溫保持在(25.0±2.0)℃，溶解氧不低于5.0 mg/L，養(yǎng)殖周期為8周。

1.2.3 樣品的采集 養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，各組試驗魚均停食24 h，之后進行樣品采集。從每個缸中隨機取試驗魚2尾，用丁香油麻醉后從尾靜脈處采血，將血液離心(3500 r/min，15 min)后分離血清，血清樣品于冰箱(-20 ℃)中保存待測。在冰盤上解剖采血后的試驗魚，分別取其前腸、中腸、后腸和肝臟，腸道樣品用預(yù)冷的0.86%的生理鹽水清洗，并通過濾紙吸干。將組織樣品與預(yù)冷的生理鹽水按1 mg∶9 mL的比例進行稀釋并勻漿，根據(jù)不同檢測指標所需條件進行離心，將離心后的上清液置于冰箱(-20 ℃)中保存待測。取魚體兩側(cè)的肌肉，去皮后放入烘箱中，在(65±2)℃條件下烘36～48 h，通過干燥器冷卻后，用小型粉碎機粉碎后置于干燥器中保存待測。

表1 基礎(chǔ)飼料的組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Ingredient and nutrient levels of the basal diet

注：1)每千克飼料中礦物質(zhì)預(yù)混料的含量：Se 0.4 mg，Zn 25 mg，Co 0.1 mg，Cu 3 mg，I 0.6 mg，F(xiàn)e 25 mg，Mn 15 mg；2)每千克飼料中維生素預(yù)混料的含量：VE 60 mg，VA 8000 IU，VB615 mg，VC 500 mg，VB120.5 mg，VB230 mg，VD33000 IU， VK35 mg，氯化膽堿5000 mg，泛酸50 mg，煙酸175 mg，葉酸5 mg，肌醇1000 mg，D-生物素2.5 mg；3)L-蘇氨酸的有效含量≥99%；4)DL-蛋氨酸的有效含量≥99%； 5)L-賴氨酸的有效含量98.5%； 6)粗脂肪和粗蛋白質(zhì)均為干物質(zhì)的實測值，其余為計算值

Note：1)Per kg of the diet contains the following minerals：Se 0.4 mg，Zn 25 mg，Co 0.1 mg，Cu 3 mg，I 0.6 mg，F(xiàn)e 25 mg，and Mn 15 mg； 2)The vitamin premix contains the following at per kg of the diet：VE 60 mg，VA 8000 IU，VB615 mg，VC 500 mg，VB120.5 mg，VB230 mg，VD33000 IU， VK35 mg，choline chloride 5000 mg，pantothenic acid 50 mg，nicotinic acid 175 mg，folic acid 5 mg，inositol 1000 mg，and D-biotin 2.5 mg；3)The actual level of L-Thr is ≥99%； 4)The actual level of DL-Met is ≥99%； 5)The actual level of L-Lys is 98.5%； 6)EE and CP values are measured in dry matter, while the others values are calculated

1.2.4 指標的測定

(1)肌肉一般營養(yǎng)成分。魚體肌肉水分采用烘干法測定，即在一個大氣壓、(105±2)℃條件下烘干，直至恒重，逸失的重量即為水分含量(GB/T5009.3—2003)；采用索氏抽提法(GB/T5009.6—2003)、全自動凱氏定氮儀(N×6.25)(GB/T5009.5—2003)、灼燒法(GB/T5009.4—2003)分別測定粗脂肪、粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量。

(2)氨基酸。準確稱取40～50 mg肌肉干樣品(精確至0.1 mg)置于50 mL安瓿瓶中。加入6 mol/L的鹽酸溶液10 mL，封管后放入(110±1)℃恒溫干燥箱中水解24 h。待冷卻后打開安瓿瓶，用2 mL雙蒸水沖洗數(shù)次后一并轉(zhuǎn)入150 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)，并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中于60 ℃條件下抽真空，蒸發(fā)至干。然后用鹽酸溶液(0.02 mol/L)洗滌蒸發(fā)瓶3～5次，洗滌液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，最后用鹽酸溶液(0.02 mol/L)定溶，搖勻后即為試樣水解液。吸取混合氨基酸標準工作液及試樣水解液2～3 mL，經(jīng)孔徑0.45 μm以下兩性濾膜直接濾入自動進樣瓶中并加蓋，通過全自動氨基酸分析儀(日立L-8900)測定。

(3)堿性磷酸酶活性。根據(jù)試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定腸道、肝臟和血清的AKP活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤(mean±S.E.)表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，若差異顯著，則用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 松浦鏡鯉肌肉一般營養(yǎng)成分

從表2可見：OKG組魚體肌肉粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組及其他處理組(P<0.05)，其他組間均無顯著性差異(P>0.05)；2Na-AKG組魚體粗灰分含量顯著高于對照組及其他處理組(P<0.05)；不同處理組魚體粗脂肪含量與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)；OKG組和AAKG組魚體肌肉水分含量均顯著低于對照組、Glu組和2Na-AKG組(P<0.05)。

表2 谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉肌肉成分的影響Tab.2 Effects of Gln and its precursors on muscle composition of Songpu mirror carp w/%

注：同列中標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences， et sequentia

2.2 松浦鏡鯉肌肉氨基酸組成

從表3可見：必需氨基酸中，AKG組、2Na-AKG組魚體肌肉異亮氨酸含量和亮氨酸含量均顯著低于對照組(P<0.05)；Glu組、2Na-AKG組賴氨酸含量均顯著低于Gln組、OKG組、AAKG組和對照組(P<0.05)，且Glu組蛋氨酸含量顯著低于對照組P<0.05)；OKG組和AAKG組蘇氨酸含量顯著高于對照組和AKG組(P<0.05)；Glu組纈氨酸含量顯著低于其他各組(除2Na-AKG組外)(P<0.05)；不同處理組中苯丙氨酸、精氨酸和組氨酸含量與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

非必需氨基酸中，Glu組和2Na-AKG組魚體天冬氨酸含量均顯著低于對照組、OKG組和AAKG組(P<0.05)，且Glu組脯氨酸顯著低于對照組(P<0.05)；不同處理組中丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和酪氨酸含量與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。

Glu組、AKG組和2Na-AKG組必需氨基酸(EAA)總量均顯著低于對照組、OKG組和AAKG組(P<0.05)；而與對照組相比，不同處理組中非必需氨基酸(NEAA)、呈味氨基酸(DAA)和總氨基酸(TAA)含量均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉肌肉氨基酸組成的影響Tab.3 Effects of Gln and its precursors on muscle amino acid composition of Songpu mirror carp %

注：同行中標有不同小寫字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)

Note: The means with different letters within the same line are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same line are not significant differences

2.3 松浦鏡鯉AKP活性

從表4可見：AAKG組和2Na-AKG組魚體前腸AKP活性均顯著高于對照組及其他處理組(P<0.05)，而各試驗組中腸和后腸AKP活性較對照組均無顯著性差異(P>0.05)；Glu組魚體肝臟AKP活性均顯著高于對照組、Gln組、AKG組和OKG組(P<0.05)；魚體血清AKP活性在不同組間均無顯著性差異(P>0.05)。

表4 谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉腸道、肝胰臟和血清中AKP活性的影響Tab.4 Effects of Gln and its precursors on AKP activities in intestine, hepatopancreas and serum of Songpu mirror carp

3 討論

3.1 谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉肌肉一般營養(yǎng)成分的影響

研究表明，不同Gln水平均對羅非魚魚體水分和粗蛋白質(zhì)含量具有顯著影響，但對粗脂肪和灰分影響不顯著[15]。對鱘魚的研究結(jié)果亦表明，飼料中添加1.2%和1.5%的Gln均可顯著提高鱘魚全魚粗蛋白質(zhì)含量，但對粗脂肪、灰分和水分含量均無顯著影響[16]。本試驗中，飼料中添加1.5%的Gln對松浦鏡鯉肌肉粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和水分含量均無顯著影響，這些結(jié)果表明，Gln對魚體體成分的影響在不同魚種間具有差異性。一些學(xué)者的研究結(jié)果表明，日糧中添加AKG對松浦鏡鯉全魚及雜交鱘幼魚體成分各指標均無顯著影響[16-17]，這與本研究結(jié)果一致，表明AKG可能對魚體主要營養(yǎng)成分沉積的影響并不明顯。李晉南等[10]對松浦鏡鯉的研究顯示，AKG、OKG、Glu對其體成分各指標均無顯著影響。而本研究結(jié)果表明，飼料中添加OKG可顯著增加鏡鯉肌肉粗蛋白質(zhì)含量，且添加2Na-AKG能顯著增加魚體肌肉中粗灰分含量，這可能與2Na-AKG中含有較高的鈉含量有關(guān)。同時，本研究中添加OKG和AAKG可顯著降低魚體肌肉中水分含量，添加AKG和OKG則可有效增加魚體肌肉中脂肪含量，這可能與AKG或OKG在機體內(nèi)直接參與供能有關(guān)，其影響機制有待于進一步研究。

3.2 谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉肌肉氨基酸組成的影響

蛋白質(zhì)營養(yǎng)從本質(zhì)上來說就是氨基酸營養(yǎng)。本研究中共檢測出17種氨基酸，其中包括9種必需氨基酸、6種非必需氨基酸和2種半必需氨基酸，非必需氨基酸中有4種(Glu、Asp、Ala和Gly)氨基酸共同組成呈味氨基酸(DAA)。研究表明，日糧中添加Gln可顯著提高肉仔雞胸脯肌肉中的必需氨基酸、呈味氨基酸、谷氨酸和苯丙氨酸的含量[18-19]。李永塘等[20]研究表明，日糧中添加AKG可有效緩解免疫應(yīng)激對仔豬氨基酸代謝的影響。陳迪[21]研究表明，飼料中添加AKG可顯著提高鱘魚Arg、Asp和Glu含量。魏玉強等[22]研究表明，飼料中添加AKG可顯著提高松浦鏡鯉肌肉中總氨基酸和呈味氨基酸含量。本研究結(jié)果顯示，飼料中添加OKG和AAKG對氨基酸總量、EAA、NEAA和DAA含量的提高均優(yōu)于其他替代物，且相對于對照組也有相應(yīng)提高，究其原因可能是由于鳥氨酸和精氨酸與AKG的協(xié)同作用導(dǎo)致魚體代謝差異所致。

3.3 谷氨酰胺及其前體物對松浦鏡鯉腸道、肝臟和血清中AKP活性的影響

AKP酶廣泛存在于動物機體的肝臟、腸道、骨骼等組織中，是經(jīng)肝臟向膽外排出的一組同工酶，能催化核酸脫掉5′端磷酸基團，且與生長相關(guān)。Lin等[5]研究表明，飼料中添加1.2%的Gln能夠顯著影響建鯉腸道的AKP活性。本研究中，飼料中添加1.5%的Gln對松浦鏡鯉魚體腸道、肝臟和血清中AKP活性均無顯著影響，表明Gln對魚體AKP的作用可能存在不同魚種的種間差異。本研究中，添加AAKG和2Na-AKG可顯著提高松浦鏡鯉魚體前腸AKP活性，而添加Glu可顯著提高魚體肝臟AKP活性，表明Gln的某些前體物可在一定程度上影響松浦鏡鯉機體與AKP活性相關(guān)的代謝活動，其作用機理有待于進一步研究。

4 結(jié)論

本研究中，飼料中添加1.5%的OKG能顯著提高松浦鏡鯉魚體肌肉粗蛋白質(zhì)及蘇氨酸含量，同時能夠顯著降低魚體肌肉水分含量；飼料中添加1.5%的AAKG和2Na-AKG能夠顯著提高松浦鏡鯉魚體前腸的AKP活性。